miR-150抑制剂通过调控SOCS1-JAK-STAT通路缓解肾脏纤维化的机制探讨

发布时间：2020-05-26 17:22

【摘要】：目的:肾脏的纤维化包括肾小球的硬化和肾间质的纤维化,是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的共同病理特征。我国CKD的发病率为10.8%,CKD最终会因肾脏的纤维化进展为终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)最终需要肾脏替代治疗维持生命,给社会和家庭带来巨大的经济负担。尽管近二十年来新药不断涌现,肾脏纤维化的发生率仍然高居不下。因此,寻找有效的药物抑制肾脏的纤维化,进而抑制ESRD的发生,将会极大的提高患者的生活质量,并给社会和家庭带来巨大的经济效益。微小RNA(microRNAs,miRs)是一种由约22核苷酸组成的短小,单链,非编码RNAs可调控人体50%基因组最终干预蛋白的翻译。近年研究证实miRs异常表达参与多种肾脏病所致肾纤维化的发生机制。本课题组既往研究发现miR-150与狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)患者肾病病理的慢性活动指数呈正相关。在体外细胞水平上进一步研究发现miR-150在通过下调其靶蛋白细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cytokine signal 1,SOCS1)来增加促纤维化蛋白合成导致肾脏纤维化发生。本研究旨在体内实验中探讨miR-150抑制剂是否可以通过抑制miR-150的表达,上调SOCS1从而缓解肾脏的纤维化,并在体外实验中探讨抑制miR-150可抑制肾脏纤维化的新机制,miR-150抑制剂有望成为治疗肾脏纤维化的新靶点。研究方法:选取近1年初发未治,经肾穿刺活检证实为LN患者的肾组织,同时选取与LN患者性别、年龄匹配的肾肿瘤患者的远瘤旁(大于5 cm)组织作为对照,石蜡切片定位miR-150的表达位置。冰冻肾组织提取miRs,检测肾组织中miR-150的表达。同时研究miR-150的表达与炎性指标纤维化指标的关系。然后给与LN小鼠皮下注射FAM标记的LNA-anti-miR-150(2mg/kg或4mg/kg)或PBS作对照。观察小鼠全身反应、6小时后收集肾组织,制作OCT冰冻组织块和miRs提取,免疫荧光观察miR-150抑制剂吸收情况,qPCR定量检测miR-150抑制水平。随后研究miR-150抑制剂在LN引起的肾小球硬化小鼠中的治疗效果,自发狼疮性肾炎的Fcgr2b基因敲除小鼠给予LNA-anti-miR-150皮下注射处理后8周后(每周两次),检测小鼠的血尿指标,PAS、MASSON病理染色,促炎因子白介素6(Interleukin-6,Il6),干扰素γ(Interferonγ,Ifnγ),肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,Tnfα)以及促纤维化因子转化生长因子(transforming growth factorβ1,Tgfβ1),平滑肌肌动蛋白(αSmooth muscle activating protein,αSma),纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn)的mRNA和蛋白水平。检测炎性细胞的浸润水平。检测SOCS1的表达。同时研究miR-150抑制剂在叶酸(folic acid,FA)诱导肾间质纤维化小鼠中的治疗效果。CD1小鼠250mg/kg叶酸诱导肾间质纤维化,并给于LNA-anti-miR-150皮下注射处理后4周后(每周两次),检测小鼠的血尿指标,病理染色,炎性和纤维化指标的变化。最后通过沉默/过表达肾小管上皮细胞(HK2)的miR-150,用巨噬细胞上清液培养24小时,检测肾小管损伤指标,炎性相关指标,纤维化相关指标,SOCS1相关通路。结果:1.LN患者的肾组织中miR-150的表达较正常肾脏组织升高,且差异具有统计学意义。miR-150主要位于肾小管上皮细胞,部分位于足细胞,少量位于上系膜细胞。LN患者肾组织中的炎性指标和纤维化指标表达均升高。2.动物实验中,FAM标示的LNA-anti-miR-150被LN小鼠肾组织广泛吸收且分布均匀,2mg/kg的miR-150抑制剂有效抑制miR-150肾脏组织的表达。3.自发狼疮性肾炎的Fcgr2b基因敲除小鼠给予LNA-anti-miR-150皮下注射处理后8周后(每周两次),肝肾功能、体重较Scrambled组相比无统计学差异,说明其安全,无肝肾及系统毒性。与Scrambled组相比,LNA-anti-miR-150抑制剂组的LN小鼠的蛋白尿、双链DNA(double strands DNA,ds-DNA)水平均下降,PAS、MASSON染色提示肾脏纤维化程度缓解。LNA-anti-miR-150使LN小鼠促炎因子IL-6,IFN-γ,TNF-α以及促纤维化因子TGF-β1,α-SMA,FN的mRNA水平和蛋白水平表达减少,抗纤维化因子SOCS1的mRNA和蛋白表达增加。并且LNA-anti-miR-150减少LN小鼠巨噬细胞浸润。4.FA诱导的肾间质纤维化小鼠给予LNA-anti-miR-150处理后4周后(每周两次),肝肾功能、体重较Scrambled组相比无统计学差异,说明其安全,无肝肾毒性及系统毒性。与对照组相比,PAS、MASSON染色提示肾脏纤维化程度缓解。并且LNA-anti-miR-150使肾间质纤维化小鼠促炎因子Il6,Ifnγ,Tnfα,促纤维化因子I型胶原蛋白(collagen I,Col1),αSma,Fn的mRNA表达减少,抗纤维化因子Socs1的mRNA表达增加,使促纤维化蛋白COL-1,αSMA,FN表达减少,抗纤维化蛋白SOCS1表达增加。LNA-anti-miR-150能减少肾间质纤维化小鼠巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润。5.HK2细胞过表达miR-150,予以巨噬细胞上清液刺激后,HK2细胞损伤严重且发生明显纤维化,SOCS1的表达下调,且两面神经酶(Janus Kinase,JAK)—信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)通路相关指标p-JAK1,p-JAK2,p-STAT1,p-STAT3的表达明显增高;HK2细胞沉默miR-150,予以巨噬细胞上清液刺激后,SOCS1的表达升高且JAK—STAT通路相关指标p-JAK1,p-STAT1的表达下调。结论:1.miR-150在LN肾活检组织中处于高表达状态且主要表达在肾小管上皮细胞,足细胞,系膜细胞上,miR-150的表达与炎症纤维化有关;2.抑制miR-150有效减轻LN引起肾小球硬化;3.抑制miR-150有效缓解肾间质纤维化;4.miR-150抑制剂通过调节SOCS1-JAK-STAT通路缓解肾脏纤维化;5.miR-150抑制剂有望成为治疗肾脏纤维化的新靶点。
【图文】：

为验证我们的新假说，我们拟从以下三部分进行研究

中国医科大学博士学位论文所有数据统计分析采用 Graphpad Prism 5 软件，数据的表现形式为均数±标准差，采用t 检验， p < 0.05认为有统计学差异。3 结果3.1 miR-150 在 LN 肾组织中的表达与定位miR-150 在始发未治的狼疮肾炎患者肾组织中高表达，主要定位在肾小管上皮细胞，部分表达在足细胞，少量表达在系膜细胞
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

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本文编号：2682171