紫花前胡苷通过抑制Snail表达延缓肾纤维化的实验研究

发布时间：2020-05-27 21:37

【摘要】：目的:肾纤维化不仅是慢性肾病的特征性病变,还是导致肾功能急剧衰竭的关键因素,目前尚无有效的治疗方法。多项研究表明肾间质纤维化的产生都与TGF-?1/Smad信号通路密切相关。本课题组在前期研究中发现:紫花前胡苷(nodakenin)可下调TGF-?1/Smad信号通路,具有改善肾脏纤维化的作用,但具体机制不清。本实验拟通过小鼠体内和细胞体外实验进一步深入研究紫花前胡苷是否通过抑制snail蛋白表达延缓肾脏纤维化。方法:1.体内实验观察紫花前胡苷对肾纤维化的作用:取6~8周龄SPF级Balb/c小鼠(雄性)28只,体重17~20 g,随机分为假手术组(Sham组)、模型组(unilateral ureteral obstraction,UUO组)、低剂量组(1 mg/kg Noda,L组)、高剂量组(10 mg/kg Noda,H组),每组7只,适应性喂养1周后按照常规方法制作UUO模型,其中Noda组、Sham组、UUO组分别给予紫花前胡苷和等体积10%Tween 80溶剂,连续灌胃7天后处死小鼠,检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)变化;HE染色观察肾脏组织结构改变和炎症细胞浸润;糖原染色(PAS染色)、Masson染色、天狼星红染色(Sirius Red)观察肾间质基质沉积和纤维化的严重程度;免疫组织化学、Western blot检测纤维化指标蛋白(α-SMA、TGF-?1、Vimentin、Fibronectin蛋白)、TGF-?1/Smad通路相关蛋白和Snail蛋白。2.体外实验观察紫花前胡苷对肾小管纤维化的作用及其机制:1)体外实验观察紫花前胡苷对肾小管纤维化的作用:采用大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)置于5%CO_2、37℃和足够湿度的培养箱中,用含10%FBS的DMEM高糖培养液培养,当细胞生长达到到80%-90%融合度,采用0.25 g/L胰蛋白酶消化、传代备用,将细胞分为对照组(CTL组)、模型组(TGF-β1组)、紫花前胡苷低剂量组、中剂量组和高剂量组(TGF-β1+10μm Noda组、TGF-β1+20μm Noda组、TGF-β1+40μm Noda组),6 ng/μL人重组TGF-β1刺激后给于不同浓度紫花前胡苷(nodakenin,Noda)干预,处理48 h后倒置显微镜、免疫荧光染色观察细胞形态变化;Western blot技术和实时荧光定量PCR检测纤维化相关蛋白、TGF-?1/Smad通路相关蛋白和Snai1蛋白的表达。2)慢病毒转染snail观察对肾小管纤维化的作用:慢病毒转染NRK-52E细胞过表达snail蛋白(snail-oe),Western blot验证转染是否成功;将细胞分为snail-oe组,snail-oe+TGF-β1组,snail-oe+TGF-β1+Noda组和snail-oe+Noda组,干预处理48 h后Western blot法检测相关纤维化蛋白、TGF-?1/Smad通路的表达。结果1、体内实验:1)血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)结果显示,与UUO组小鼠相比,高剂量紫花前胡苷组可明显下降,差异有统计学意义;2)病理染色发现,UUO组小鼠的肾脏发生严重的肾小管扩张,肾小管上皮细胞脱落表现,扩张的肾小管区域显示大量基质沉积,出现严重的间质纤维化纤维化区域,H组小鼠与其相比,肾小管扩张、基质沉积以及纤维化区域均出现明显减少,表明紫花前胡苷可显著延缓UUO的病理改变。3)Western blot法检测结果显示,与UUO组结果相比,紫花前胡苷干预可以明显降低UUO小鼠纤维化相关蛋白(α-SMA、TGF-?1、Vimentin和Fbironectin)、TGF-?1/Smad通路和Snail蛋白的过表达;而与UUO组相比,低剂量组(L组)的作用并不明显。2、体外实验:1)与CTL组比较,TGF-β1组刺激48 h后,细胞体积变大,失去极性,E-cadherin的表达相对变少,而加入紫花前胡苷干预后可以抑制这种现象;2)qPCR、Western blot结果显示,与CTL组相比,TGF-β1组纤维化相关蛋白表达明显升高,加入紫花前胡苷干预,尤其是20μm紫花前胡苷可以明显降低这些蛋白的表达;3)实验结果显示,与CTL组相比,TGF-β1组的TGF-β1/Smad信号通路的各蛋白和Snail蛋白表达明显升高,经紫花前胡苷干预可以降低它们在细胞中的表达;4)紫花前胡苷在snail过表达后的干预作用消失,不能有效抑制相关纤维化蛋白和TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的表达。结论:1、紫花前胡苷可延缓肾间质纤维化部分恢复UUO小鼠受损肾功能;2、紫花前胡苷可以降低TGF-β1刺激NRK-52E产生的相关纤维化蛋白和TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的表达;3、紫花前胡苷延缓肾间质纤维化的作用是依赖Snail蛋白表达。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

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本文编号：2684175