hTERT启动子调控元件的构建及其在膀胱癌靶向治疗中的应用

发布时间：2020-05-30 21:17

【摘要】：目的:为了探索膀胱癌特异性治疗方法,本研究采用合成生物学的原理,设计、构建合成调控元件,特异性地识别和杀伤膀胱癌细胞。方法:构建由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子驱动的酵母转录激活蛋白GAL4载体、由上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)驱动的CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system)载体并在细胞内共转染表达。采用双荧光素酶报告实验验证hTERT启动子在人成纤维细胞HFF、膀胱癌细胞5637和T24中对下游基因的激活转录活性及GAL4/UAS二元表达系统在各细胞系中的调控作用;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测HRAS基因在对照组细胞和实验组细胞中的表达量变化;采用Sanger测序法检测对照组细胞与实验组细胞中HRAS基因靶序列是否被剪切;采用CCK-8法、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell实验,检测合成调控系统对于膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:双荧光素酶实验结果显示,hTERT启动子在膀胱癌细胞T24和5637细胞中对下游基因有转录激活能力,而在人成纤维细胞HFF细胞中对下游基因无转录激活能力;在T24和5637细胞中,融合蛋白GAL4-P65对上游激活序列UAS的激活效果显著性地高于GAL4-VP64。qPCR结果显示,靶向HRAS基因的调控元件显著性地降低了HRAS在T24和5637中的表达。Sanger测序结果显示,在T24和5637细胞中,调控元件对HRAS基因进行了基因剪切。CCK-8法、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,人工合成调控元件对HFF细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭无明显影响,但明显地抑制了膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进了细胞凋亡。结论:由增强型hTERT启动子、GAL4/UAS系统和CRISPR-Cas9工具组成的调控系统可以特异性地剪切膀胱癌细胞T24和5637中的HRAS基因,抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;对正常细胞无明显影响。
【图文】：

荧光,表达水平,质粒,细胞系

图 3.1 在 HFF、T24 及 5637 细胞中不同种类质粒的荧光表达水平。经双荧光素酶报告实验检测 HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) 细胞中的荧光强度。在这三个细胞系中，CMV-GAL4-P65 组激活荧光的能力要高于 CMV-GAL4-VP64 组。然而，在 T24细胞系和 5637 细胞系中，hTERT-GAL4-p65 组荧光表达要明显强于对照组，，在 HFF细胞系中没有差别。数据以平均±标准差(SD)表示。每个实验被重复三次，每次设有三个重复组。每个误差条表示三个独立实验的平均值之间的变化。Fig. 3.1 Luciferase expression levels of several different kinds of vectors in HFF, T24and 5637 cells. The luciferase activities in HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) cells weremeasured by the dual luciferase reporter assay. The luciferase activities in theCMV-GAL4-P65 group were significantly higher than those in the CMV-GAL4-VP64group in these three cell lines. However, while the activities in the hTERT-GAL4-p65

膀胱癌细胞系,基因,细胞系

采用实时荧光定量 PCR 检测经慢病毒转染后的细胞系 T24 和 5637 及人成纤维细胞 HFF 的 HRAS 表达量，如图所示，与人成纤维细胞系 HFF 相比，转染人工合成载体后，HRAS 基因在 T24 和 5637 细胞中都有明显的下调，差异具有统计学意义。而在 HFF 细胞系中，则无明显变化，差异无统计学意义。(*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

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