NLRC5在透明细胞肾细胞癌中的功能与机制研究

发布时间：2020-06-02 12:04

【摘要】：肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),简称肾癌,是泌尿系统位列第二的肿瘤,在成人恶性肿瘤中所占比例约为3%,其中最常见的病理类型为透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC),约占全部肾细胞癌的75%。30%的肾细胞癌患者在初诊时已进入进展期和发生转移。进展期或转移的患者五年生存率很差,可能是发生了转移和耐药。因此,探讨肾脏透明细胞癌发病机理并寻找有效的治疗方法至关重要。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5)是最新发现的NLRs(NOD like receptors)家族成员,NLRC5可通过NF-κB、I型干扰素(IFN-I)及MHC-I基因的表达来参加机体的炎症和免疫的调节,尤其是与肿瘤的发生和发展关系密切。本课题组之前发现NLRC5在肝癌的组织及细胞中高表达,通过正向调控Wnt/β-catenin信号通路调节肝细胞癌的细胞增殖,侵袭和迁移。而其在透明细胞肾细胞癌中的研究至今未见报道。本研究中,来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库显示,NLRC5在透明细胞肾细胞癌组织中表达高于正常组织,并且NLRC5的表达量与患者生存预后和临床分级密切相关。随后,本实验进一步探讨了NLRC5对透明细胞肾细胞癌细胞系的增殖、侵袭和迁移能力的影响,并初步探讨其可能作用机制。方法1.首先从TCGA数据库中提取透明细胞肾细胞癌患者RNA-seq数据分析,分析癌组织和癌旁组织中NLRC5基因(mRNA)差异,并进一步探讨了NLRC5基因表达与患者临床分级和预后的相关性。2.从收集人肾透明细胞癌组织和癌旁正常肾脏组织,RT-PCR,Western blotting和免疫组织化学染色法检测人肾透明细胞癌组织中NLRC5的表达变化。同时利用Western blotting和RT-PCR检测人类正常肾小管上皮细胞HK-2和三种肾癌细胞株Caki-1、786-O和769-P中NLRC5的表达水平。3.采用转染试剂LipofectaminTM 2000将过表达的pEGFP-C3-NLRC5重组质粒和沉默NLRC5的小干扰RNA转入786-O和769-P细胞系中,RT-PCR和Western blotting检测NLRC5的mRNA和蛋白表达水平。4.采用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移侵袭实验及相关蛋白表达进行体外细胞功能分析,同时观察NLRC5表达变化对肾透明细胞癌细胞系中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响。5.将细胞分为两组NC细胞(786-O)和稳定低表达NLRC5细胞(786-O),将5×10~6/200μl细胞注射于裸鼠右前肢腋下,每周测量肿瘤体积,第八周处死裸鼠,剥取肿瘤,称量肿瘤重量,并检测两组肿瘤相关蛋白。结果1.TCGA数据库结果表明,与正常组织相比,癌组织中NLRC5的mRNA水平显著升高,高表达NLRC5患者较低表达患者预后生存差,并且等级为T3-T4的患者NLRC5表达水平明显高于T1-T2的患者。2.肾透明细胞癌组织的NLRC5蛋白和mRNA表达明显高于癌旁组织,肿瘤细胞系中NLRC5蛋白和mRNA水平也高于正常的肾小管上皮细胞HK-2。3.Western blotting和RT-PCR实验结果表明瞬时低表达或高表达NLRC5的细胞系转染成功。4.过表达NLRC5能明显加强786-O和769-P细胞增殖、侵袭和与移能力,同时Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin、c-Myc和cyclinD 1蛋白水平表达量显著升高。沉默NLRCS可明显抑制786-O和769-P细胞系增殖、迁移与侵袭能力,同时也负向调控Wnt/β-catenin信号通路。5.低表达NLRC5组肿瘤的生长较NC对照组慢,第八周剥取的肿瘤重量也较NC组轻,Western blotting结果表明低表达NLRC5组肿瘤中MMP2,MMP9,PCNA,β-catenin,c-Myc和cyclinD1蛋白比对照组NC低。结论NLRC5通过靶向Wnt/β-catenin信号通路促进透明细胞肾细胞癌增殖、迁移和侵袭功能。
【图文】：

肾透明细胞癌,肾细胞癌,透明细胞,肿瘤组织

图1：（A）TCGA数据库中，NLRC5在肾透明细胞癌肿瘤组织与癌旁正常肾脏组织中NLR表达情况；（B）NLRC5基因表达量与透明细胞肾细胞癌患者生存之间的关系（以均数为标将表达量分为高低两组）；（C）NLRC5表达量与肾透明细胞癌患者临床分级关系。Fig. 1 (A) Box and whisker plots for NLRC5 gene expression in ccRCC tissues comparednormal kidney tissues from TCGA. (B) Kaplan-Meier survival plot represents overall survivaccRCC patients in TCGA for ccRCC patients categorized according to NLRC5 gene express(high vs low in comparison to the mean expression). (C) T stages analysis based on TCGA databshowed that ccRCC tissues stained with higher level of NLRC5 were associated with higher stprognosis. The T3-T4 vs. the T1-T2. *P< 0.05, **P<0.01, *** P<0.001.4.2 NLRC5在透明细胞肾细胞癌组织中以及透明细胞肾细胞癌细胞系中表达升高收集临床样本，，Western blotting和RT-PCR结果均表明癌组织中NLRC5表达

肾细胞癌,透明细胞,癌组织,脏结

安徽医科大学硕士学位论文疫组化染色实验（图 3A），HE染色中，癌旁组织肾脏结构较正常，癌组织中肾脏结构明显发生病变，免疫组化结果中，癌旁组织几乎不表达NLRC5，而癌组织中有明显褐色，证明NLRC5高表达。HK-2细胞为正常肾小管上皮细胞，Caki-1，786-O,和769-P为透明细胞肾细胞癌细胞系，癌细胞系中NLRC5蛋白和mRNA表达量均明显高于正常细胞HK-2（图 3B和C），差异有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明NLRC5可能在透明细胞肾细胞癌发生发展中发挥着作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.11

【相似文献】