PMC神经元集群活动的排尿控制作用及初步机制研究

发布时间：2020-06-02 16:22

【摘要】：机体通过排尿活动将代谢废物排出体外,从而达到维持正常生命活动和体液平衡的目的。膀胱正常的生理功能是存储尿液和排空尿液,其神经调控机制极其复杂,需要在大脑、脊髓及外周神经系统的共同精细调控下完成。上述任意层面的损伤或病变,均可能引起神经源性膀胱功能障碍(neurogenic bladder dysfunction,NGB)。许多患有神经系统疾病的病人,如多发性硬化症、帕金森病、脊髓损伤和脊柱裂等,都伴有神经源性膀胱功能障碍。NGB常见的临床症状主要表现为尿频、尿急、尿失禁,有些患者甚至无法排尿以及伴有上尿路的感染。然而,我们现阶段对神经源性膀胱功能障碍的认识仍十分有限,其发病机理和病理生理过程亟待进一步研究。故深入解析调控膀胱的神经网络、探究生理性排尿行为的神经编码模式,将为神经源性膀胱功能障碍的诊断和治疗提供新的策略。全面解析大脑与膀胱间的神经环路结构,是研究大脑调控膀胱功能及相关病理生理机制的基石。近年来神经解剖示踪技术发展迅速,一种名为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的疱疹病毒横空出世,该病毒可以逆行跨越多级突触结构,使解析外周脏器与大脑之间的神经传导通路成为可能。此外,探究调控膀胱或排尿活动相关脑区的神经编码模式,是解析大脑调控膀胱和排尿活动神经机制的最佳策略。随着基因编码钙离子指标剂(genetically encoded Ca~(2+)indicators,GECIs)和基因靶向技术的发展,基于光纤的神经钙活动探测技术(又称为光纤光度法)成为了当下最流行的解析神经活动模式的研究技术。该方法可以在自由活动且清醒小鼠任意脑区进行神经元集群活动的监测。光纤光度法主要通过检测神经元集群的钙活动(钙信号),来反映这群神经元的平均簇状放电活动和动作电位发放水平。与传统的电生理技术相比,它具有易于上手、实验成本低和数据分析便捷等优势。通过运用上述两项技术,本课题旨在解析中枢神经系统与膀胱之间的神经环路连接结构,并揭示脑桥排尿中枢(pontine micturition center,PMC)神经元集群在排尿活动和膀胱不同状态下的活动特征和机制。我们主要开展了以下实验:(1)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的神经元在脊髓和外周神经的分布情况,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,我们对其脊髓和膀胱组织进行切片和免疫组化处理,再使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在切片中的分布;或者运用荧光显微切片断层成像(Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography,fMOST)技术直接对小鼠脊髓组织进行连续切片和荧光图片采集。(2)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的脑区分布,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,我们对其脑组织进行切片和免疫组化处理,再使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在切片中的分布,或者运用fMOST技术直接对脑组织进行连续切片和荧光图片采集。为了明确雌性和雄性小鼠参与支配膀胱逼尿肌的脑区分布是否有差别,我们分别对雌性和雄性小鼠的膀胱进行了PRV-EGFP注射。为了明确膀胱感染PRV不同时间点对PRV脑内标记的影响,我们分别获取了膀胱感染PRV-EGFP3天、4天和4.5至5天的小鼠脑组织。为了明确参与支配膀胱逼尿肌不同部位的脑区是否存在差异,我们分别将PRV-EGFP和PRV-RFP注射入膀胱左右侧壁内。(3)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的大脑皮层区域的具体定位,我们运用fMOST技术对PRV-EGFP标记的皮层区域进行连续切片和数据采集,并观测PRV-EGFP标记的皮层区域的具体位置;或者使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的皮层区域的具体位置。(4)为了明确参与支配膀胱逼尿肌的PMC区的精准坐标,我们将共聚焦采集到的PMC形态学结果与经典小鼠脑图谱进行对比。为了明确PMC的上游脑区,我们通过脑内病毒注射技术将腺相关病毒(AAV-Retro-hSyn-EYFP)注射入小鼠的PMC脑区内,病毒表达一个月后,我们对小鼠脑组织进行切片,并使用共聚焦显微成像技术观测PRV-EGFP标记的细胞在脑内的分布。(5)为了明确PMC神经元集群的活动是否与清醒自由运动小鼠的排尿活动相关联,我们运用基于光纤的神经钙活动记录技术来探测PMC神经元集群的活动,并同步记录小鼠的排尿行为。(6)为了明确PMC神经元集群的活动是诱发小鼠排尿活动所必须的条件,我们通过将GABA受体的激动剂(muscimol)注入双侧PMC来阻断PMC神经元集群的活动,再评估小鼠排尿活动的变化情况。(7)为了明确PMC神经元集群的活动是否与膀胱逼尿肌的收缩相关联,我们运用基于光纤的神经钙活动记录技术来探测PMC神经元集群的钙活动,并同步记录小鼠(麻醉状态下或清醒自由活动状态下)的膀胱压力。(8)为了进一步验证PMC神经元集群的活动是否是膀胱逼尿肌收缩所必须的条件,我们运用基于光纤的神经钙活动记录技术来探测PMC神经元集群的钙活动,并同步记录不同麻醉方式下小鼠的膀胱压力(异氟烷和乌拉坦)。通过深度气体麻醉(2.5%异氟烷)的方式来阻断PMC的神经活动,再评估其对膀胱测压过程中逼尿肌周期性收缩的影响。主要研究结果:(1)PRV标记的神经元在小鼠脊髓和外周神经中的分布PRV-EGFP标记膀胱内的神经纤维,这些神经纤维来自于外周神经节内的神经元。在脊髓中,我们发现在腰骶髓中间外侧柱区域(the intermediolateral area,IML)、背侧灰质后连合(the dorsal gray commissure,DGC)和脊髓背角浅层(the superficial dorsal horn,SDH)均有PRV-EGFP标记的神经元;位于IML中的骶髓副交感神经元(the sacral parasympathetic preganglionic neurons,SPN)也感染了PRV-EGFP;在L1-L2中PRV-EGFP感染的神经元主要分布在这些脊髓层面的中间外侧柱区域(IML)和背侧灰质后连合(DGC),而颈段脊髓鲜有PRV-EGFP感染的神经元。(n=5只雄性小鼠)(2)PRV标记的神经元在小鼠大脑内的分布PRV-EGFP标记的神经元主要分布在:脑桥排尿中枢(PMC)、网状核(gigantocellular reticular nucleus,Gi)、髓中缝核(Raphe nuclei)、蓝斑核(locus coeruleus,LC)、脑干A5细胞群组、中脑导水管灰质区(periaqueductal gray,PAG)、红核(Red nucleus)、下丘脑的内侧视前区(medial preoptic area,MPA)、下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)、外侧下丘脑(lateral hypothalamic area,LH)和部分大脑皮层区域(n=5只雄性小鼠)。在对照组(PRV-EGFP注射入下腹壁)中,上述脑区均未发现PRV标记的神经元(n=3只雄性小鼠)。我们运用fMOST技术和三维重建法,率先绘制出了支配雄性小鼠膀胱逼尿肌相关脑内神经元的三维脑图谱。同一只雄性小鼠的膀胱左右侧壁分别注射PRV-EGFP和PRV-RFP病毒后,两种PRV感染的主要脑区相同;雌鼠膀胱注射PRV后,PRV感染的脑区与雄鼠的结果相同(n=3只小鼠/组)。PRV-EGFP注射3天后,大脑内仅在PMC和Gi区发现少量PRV-EGFP标记的神经元;PRV-EGFP注射4天后,上述主要脑区均出现PRV-EGFP标记的神经元(n=3只雄小鼠/组)。(3)PRV标记的神经元在大脑皮层的分布PRV-EGFP标记的小鼠大脑皮层区域为初级运动(primary motor cortex,M1)和感觉皮层(primary somatosensory cortex,S1),这些神经元主要位于它们的第五层,从形态学上判断它们都是椎体神经元;通过fMOST技术和三维重建,我们明确了整个PRV-EGFP标记的皮层区域的范围(前后跨度约为960μm)和PRV-EGFP标记的皮层神经元总数目(约为970个,n=3只雄性小鼠),PRV感染膀胱4天后皮层才出现PRV-EGFP标记的神经元(n=3只雄性小鼠)。上述结果提示皮层是PMC的上游脑区。(4)PRV标记的神经元在PMC的精确定位和PMC上游脑区的分布小鼠核心PMC区的坐标:AP为-5.45 mm,ML为±0.7 mm,DV为-3.15 mm。PMC的上游脑区,主要包括PAG、M1、S1、PVN、LH和前额叶皮层在内的多个脑区,这些区域内的神经元可以直接投射至PMC(n=3只雄性小鼠)。(5)PMC神经元集群的钙信号(神经活动)与清醒自由运动小鼠的排尿活动密切相关小鼠自主排尿活动时,实验组(PMC神经元表达GCaMP6f)小鼠可以稳定地记录到与排尿活动高度相关的钙信号,而对照组(PMC神经元表达EGFP)小鼠则未记录到与排尿活动高度相关的钙信号。定量对比显示实验组小鼠排尿过程中PMC神经元集群荧光强度变化的幅值明显高于对照组(PMC神经元表达GCaMP6f组,maxΔf/f=36.73%±4.90%;PMC神经元表达EGFP组,maxΔf/f=2.24%±0.66%;P0.001;n=7只小鼠/组)。由于对照组小鼠未记录到明显的PMC神经元集群荧光强度变化,进一步证实了我们所记录到的小鼠排尿相关的钙活动,代表PMC神经元的激活反应,而不是小鼠运动引起的运动噪音或者是“伪信号”。进一步对实验组小鼠所记录到的自主排尿活动相关PMC神经元集群钙信号进行深入分析,我们发现排尿相关的PMC神经元集群的活动(钙信号)有以下几个特点:1.PMC区神经元集群钙信号的起始早于小鼠排尿活动的起始,提前的时间约为402±21 ms;2.实验组小鼠每次排尿活动都能记录到对应的PMC区神经元集群的钙信号,而对照组动物每次排尿活动都不能记录到PMC区神经元集群的钙活动,;3.对实验组动物排尿活动相对应的钙信号进行随机采样处理后(shuffled处理),未发现与排尿活动相对应的钙活动;PMC区神经元集群钙信号的半高宽与小鼠排尿活动的持续时间,呈线性正相关的关系。(6)药理学阻断PMC神经元集群的活动后损伤小鼠的排尿活动先在腹腔注射2 ml生理盐水,增加小鼠单位时间内自主排尿活动的次数。在4小时实验过程中,与两种对照组小鼠(muscimol失效组,n=6只小鼠;PMC注射ACSF组,n=6只小鼠)相比,实验组小鼠(PMC注射muscimol组,n=9只小鼠)的排尿次数明显减少(P0.01),排尿的时间间隔和第一次排尿的潜伏期明显延长(P0.01),总排尿量减少(P0.01),但单次排尿的量显著增加(P0.01)。部分实验组小鼠表现为急性充盈性尿失禁,另一部分实验组小鼠没有出现排尿活动。(7)PMC神经元集群的钙活动与小鼠膀胱逼尿肌的收缩功能密切相关在麻醉小鼠(乌拉坦)不同的膀胱灌注速度下,每次膀胱排尿性收缩过程中(尿液排空过程),均会记录到与之相对应的PMC神经元集群的活动;而储尿过程中未见明显PMC神经元集群的钙信号。在自由活动的小鼠中,每次膀胱排尿性收缩过程中(尿液排空过程),均会记录到与之相对应的PMC神经元集群的钙信号;而储尿过程中未见明显的PMC神经元集群的活动。相关性分析显示每次膀胱逼尿肌的收缩与PMC神经元集群的钙活动密切相关(data,0.51±0.08;shuffled,0.09±0.03;P0.01;n=8只小鼠)。(8)抑制PMC神经元集群的钙活动损伤小鼠膀胱逼尿肌的收缩功能实验组(深度气体麻醉)PMC的神经活动被阻断后,无法记录到PMC神经元集群的钙活动,也不能记录到膀胱周期性的收缩活动;而对照组(乌拉坦麻醉)PMC的神经活动没有被阻断,可以记录到膀胱周期性的收缩活动(n=4只小鼠/组)。总结上述实验结果,本研究主要的结论有:大脑、脊髓和外周围神经构成了支配膀胱逼尿肌的多层次神经网络结构;整个膀胱逼尿肌接受相同脑区的神经支配;支配膀胱逼尿肌的脑神经网络不存在性别差异;位于M1和S1区第五层的椎体神经元参与支配膀胱逼尿肌;PMC有多个上游脑区,如皮层、PAG和LH等;PMC神经元集群的活动与排尿活动和膀胱逼尿肌的收缩功能密切相关;PMC神经元集群的激活是启动正常排尿活动和膀胱逼尿肌收缩的最基本条件。
【图文】：

示意图,示意图,脊髓,膀胱逼尿肌

图 1-1：PRV-EGFP 成功注射入膀胱壁内（a）膀胱壁内注射 PRV-EGFP 的示意图（b）膀胱壁内的神经纤维被 PRV-EGFP 感染（绿色的纤维）。Figure 1-1：PRV-EGFP was injected into into the bladder wall of each adult male mouse successfu(a) Schematic of PRV-EGFP injection into the bladder wall. MPG, major pelvic ganglion. (b) The nerfibers in the bladder wall were infected with PRV-EGFP.接着，我们对脊髓进行了冰冻切片和免疫组化，，并使用共聚焦荧光成像技术对腰骶髓（L6-S1）进行了观测，发现在腰骶髓中间外侧柱区域（the intermediolateral area，IML）、背侧灰质后连合（the dorsal gray commissure，DGC）和脊髓背角浅层（tsuperficial dorsal horn，SDH）均有 PRV-EGFP 感染的神经元（见图 1-2b）；其中位于IML 中的骶髓副交感神经元（the sacral parasympathetic preganglionic neurons，SPN）也感染了 PRV-EGFP，这群神经元发出的节后神经纤维可以直接支配膀胱逼尿肌的收缩[2]。我们采用荧光显微切片断层成像（fMOST）技术对 L1-L2 以上的脊髓进行了连

脊髓,神经元,后连合,膀胱逼尿肌

节段被 PRV-EGFP 标记的神经元的分布。（a）L1-L2后连合（DGC）存在 PRV-EGFP 标记的神经元（见图经元。（b）PRV-EGFP 感染的神经元在 L6-S1 脊髓节istribution of PRV-EGFP labeled neurons in different se neurons were mainly found in the L1-L2 spinal cord seg neurons were mainly found in the L6-S1 spinal cord se膀胱逼尿肌相关脑内神经元在雄性小鼠大脑中进行了共聚焦显微成像或 fMOST 成像。我们发在：脑桥排尿中枢（PMC）、中脑导水管灰质区（LC）、脑干 A5 细胞群组、下丘脑的内侧视前侧下丘脑（lateral hypothalamic area，LH）、红
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R694.5

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