单核苷酸多态性rs762551与膀胱癌发病风险及预后的关联性研究

发布时间：2020-06-02 17:01

【摘要】：膀胱癌(Bladder cancer,BC)作为目前临床发病率较高的恶性肿瘤之一,其在男性癌瘤发病率中排名第七位,在女性癌症发病率排名第十七位。近年来因化工产品职业暴露因素及环境污染问题的加重,膀胱癌的发病率及死亡率呈现逐年攀高趋势。以往普遍认为环境因素在膀胱癌的发生发展过程中发挥着重要作用,但近些年研究证实遗传因素同样在膀胱癌进展过程中有着不可忽视的作用,与没有膀胱癌家族史人群相比,膀胱癌患者直系亲属发病率显著增加,提示个体基因易感性与膀胱癌的发生密切相关,表明遗传易感性与环境因素可通过交互作用共同参与调控膀胱癌病理机制。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是广泛存在于生物体基因组中的一种核苷酸多态性,即在不同物种个体间,基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸发生替代、插入或缺失等变异,使得相同位点上单个核苷酸发生改变,当这种等位基因突变频率0.01时即可被定义为SNP位点,各国学者普遍认可SNP是引发个体疾病易感差异性的遗传学基础,对不同基因单核苷酸多态性探索已成为目前疾病和环境基因组学研究的核心内容。目前,针对膀胱癌基因易感性国内外学者已进行了大量的研究,多个与膀胱癌相关的基因突变位点得到了确认。化学致癌物作为诱发膀胱癌的关键性风险因子,吸烟与特定致癌物的职业暴露为罹患膀胱癌的主要危险因素,尤其是长期暴露于芳香胺类、多环芳烃及氯化烃等致癌物。这些物质进入体内后需在肝脏内经多种生物酶作用后使其结构发生不同程度的改变,最终以原型或代谢产物形式(有活性或无活性)被清除。一般来讲其在体内的生物转化过程包括两个阶段,分别为Ⅰ相代谢即为氧化、还原和水解过程,第二阶段为Ⅱ相代谢即通过结合作用。涉及Ⅰ相代谢酶类主要是细胞色素P(cytochrome P,CYP)450酶系,CYP1A2作为CYP酶系超家族的重要成员之一,研究显示其在诸多药物和致癌物所致疾病的发生过程中有着重要作用,CYP1A2催化底物多为一些极性较大、分子量低或致癌性物质包括芳香胺类、卤代烃类化合物及亚硝胺类,在其催化作用下上述物质可经氧化代谢转变为毒物或致癌物诱发多种毒性作用。CYP1A2定位于15号染色体基因上,其中位于内含子1的-163位点rs762551在中国人的发生率比较高。以往研究显示CYP1A2 rs762551基因多态性与诸多疾病的发生发展相关。鉴于芳香胺类、多环芳烃等致癌物在膀胱癌发生发展过程中的风险作用,而CYP1A2与上述物质的解毒清除过程密切相关,我们推测CYP1A2 rs762551基因多态性可能与膀胱癌的发生发展存在相关性。到目前为止,关于我国人群中CYP1A2 rs762551基因多态性与膀胱癌易感性相关性研究尚属空白。因此本课题旨在通过病例一对照分析,探讨染色体CYP1A2 rs762551区域基因多态性与中国人群膀胱癌发病相关性,实验将研究对象限定在中国汉族人群膀胱癌患者,并且按照膀胱癌国际多学科分类将病例重新进行病理分型后,以探讨该位点多态性与膀胱癌患者的性别、吸烟状态、病理类型及TNM临床分期等相关性,并进一步明确该多态性基因与膀胱癌患者预后关联性,同时探讨该基因多态性对CYP1A2活性的影响,以期今后为膀胱癌高危人群的筛查、早期诊断和个体化治疗提供理论依据和数据基础。研究目的探讨染色体CYP1A2 rs762551区域基因多态性与中国人群膀胱癌发病相关性;明确该位点多态性与膀胱癌患者的性别、吸烟状态、病理类型及TNM临床分期等相关性;分析该多态性基因与膀胱癌患者预后关联性;探索该基因多态性对CYP1A2活性的可能影响。研究方法1.收集200例正常对照和200例膀胱癌患者血液标本,提取基因组DNA。利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,对正常对照组和膀胱癌患者样本CYP1A2基因rs762551位点进行基因分型,明确其基因型分布,应用卡方检验和Logistic回归分析探讨该位点基因型与膀胱癌发病风险的关系。2.应用卡方检验分析CYP1A2基因rs762551多态性基因频率与我国膀胱癌患者病理分期、分级相关性,明确CYP1A2多态性rs762551基因型膀胱癌患者术后进展及复发关联性。3.选取健康体检人群,经PCR-RFLP技术对CYP1A2 rs762551多态性位点进行基因分型检测,分别选取CYP1A2-163C位点CC、CA、AA基因型患者各10例,共30例患者,口服咖啡因后,4 h后采集静脉血,RP-HPLC法检测各受试组探药浓度以及相应代谢产物的浓度,采用1,7二甲基黄嘌呤与咖啡因的比值来表示CYP1A2的活性,对比分析CYP1A2多态性rs762551基因型人群CYP1A2酶活性的差异性。结果1.选取研究对象412例,膀胱癌组共212例患者,其中男性127例,占病例组人数的59.91%,女性患者85例,占40.09%,膀胱癌组人群平均年龄为63.71±15.63岁;对照组200例,其中男性135例,占对照组人数的67.50%,女性65例,占比32.50%,两组人群在年龄构成及性别构成无统计学意义(P0.05)。此外病例组人群中饮酒者及吸烟所占比例与对照组人群无显著性差异。评估膀胱癌患者组肿瘤进展程度,可见膀胱癌患者组中低级别患者和高级别患者分别为87例和125例,占比为41.04%和58.96%。非肌层浸润性尿路上皮癌(NMIBC)患者和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者分别为123例和89例,占膀胱癌患者组总人数的58.02%和41.98%。2.实验组和对照组共纳入412例研究对象,其中病例组212例,对照组200例,PCR-RFLP法分型检测CYP1A2基因rs762551位点,共检测到野生型(C/C)、突变杂合子(C/A)、突变纯合子(A/A)三种基因型。分析结果显示膀胱癌患者组及对照组中CYP1A2基因rs762551位点三种基因型所占比例分别为:对照组 CC 64.00%(128/200)、CA 27.50%(55/200)、AA 8.50%(17/200);膀胱癌患者组 CC 34.91%(74/212)、CA 41.98%(89/212)、AA 23.11%(49/212)。各等位基因在各组中的分布率分别为:对照组人群中C和A等位基因占比分别为77.75%和22.25%;膀胱癌患者组中C等位基因占55.90%,A等位基因占44.10%。统计结果显示膀胱癌患者组中CC基因型频率明显低于对照组(34.91%vs.64.00%),但CA和AA基因型在膀胱癌患者组中分布频率明显高于对照组;与正常组相比,C等位基因在实验组中的分布频率较低,上述结果证实膀胱癌患者组和正常人群组中CYP1A2基因rs762551位点的基因频率和等位基因频率存在显著性差异。3.Logistic回归分析显示CYP1A2基因rs762551位点A等位基因(CA+AA)携带者人群膀胱癌的发病风险性高于CC基因型携带人群(OR=3.72,95%CI:1.55-7.16,P=0.02)。对比A与C等位基因分布频率,发现相对于C等位基因,A等位基因与膀胱癌发病风险性存在明确相关性(C与A:OR=4.89,95%CI:2.78-10.87,P= 0.01)。4.我们依据膀胱尿路上皮癌病理分级(低级别vs高级别)对其与单核苷酸多态性rs762551相关性进行分析。在低级别膀胱癌患者组中,CC、AA及CA基因型占比分别为43.68%(38/87)、17.24%(15/87)和39.08%(34/87);高级别患者组中,CC、AA及CA基因型占比分别为28.80%(36/125)、27.20%(34/125)和44.0%(55/125),低级别膀胱癌患者组AA基因型频率明显低于高级别组(P=0.02);Logistic回归统计分析显示,在校正年龄、性别及吸烟史等因素后,CYP1A2基因rs762551位点含有A等位基因的基因型(CA及AA)患者其高级别膀胱癌(OR=1.92,95%CI=1.08-3.40,P=0.02)发病风险性显著上升。5.我们探讨了rs762551位点单核苷酸多态性与膀胱癌患者病理分期(NMIBC vs MIBC)相关性,123例NMIBC癌患者组中,CC、AA及CA基因型占比分别为32.52%(40/123)、47.15%(58/123)和20.33%(25/123);89例MIBC患者组中,CC、AA 及CA基因型占比分别为38.20%(34/89)、34.83%(31/89)和26.70%(24/89),NMIBC患者组CC、AA及CA三种基因型频率与MIBC患者组无明显差别(P=0.02);Logistic回归统计分析显示,在校正年龄、性别及吸烟史等因素后,CYP1A2基因rs762551位点含有A等位基因的基因型(CA及AA)与膀胱癌病理分期无明显相关性。6.本研究中我们对212例膀胱癌患者预后进行了随访,共计205例完成了全部随访,7例失访,随访期内无病患死亡。参照预后情况(肿瘤复发及进展)对患者进行分组设为复发组与无复发组、进展组与无进展组,对比分析两组患者年龄、性别、吸烟状况、肿瘤分期和肿瘤分级等临床病理资料,统计结果如下:膀胱癌患者组中肿瘤复发与无复发人数所占比例分别为34.6%(71/205)和65.4%(134/205);两组患者在年龄构成(≤65 vs≥65)、性别比例(男vs女)、吸烟状况(吸烟vs未吸烟)、肿瘤分期(NMIBC vs MIBC)和肿瘤分级(低级别vs高级别)临床特征上均无明显差异(P0.05)。肿瘤进展患者组与无进展患者组病例占比例分别为14.6%(30/205)和85.4%(175/205),两组间患者在年龄构成(≤65 vs≥65)、性别(男vs女)临床特征上均无统计学差异(P0.05),但在吸烟状况(吸烟vs未吸烟)、肿瘤分期(NMIBC vs MIBC)和肿瘤分级(低级别vs高级别)存在明显差异(P0.05)。7.分析复发及未复发患者组rs762551位点CC基因型与AA/CA基因型分布频率,可见CC基因型患者组在复发与未复发人数中所占比例分别为29.17%(21/72)和70.83%(51/72),AA患者组在复发与未复发人数中所占比例分别为39.58%(19/48)和64.71%(29/48),CA基因型复发与未复发人数中所占比例分别为35.29%(30/85)和64.71%(55/85),复发及未复发患者组中CC与AA/CA基因分布频率无明显差异(P=0.240.41),而在肿瘤进展(进展vs未进展)的CC基因型与AA基因型在频率分布上则可见显著性差异(P=0.01),CC基因型患者组在肿瘤进展与未进展人数中所占比例分别为6.94%(5/72)和93.06%(67/72),AA基因型患者组在肿瘤进展与未进展人数中所占比例分别为12.94%(11/85)和87.05%(74/85),CA基因型患者组在肿瘤进展与未进展人数中所占比例分别为29.17%(14/48)和70.83%(34/48)。等位基因分析结果显示,肿瘤复发患者组rs762551位点CC基因型与A基因携带患者分布频率无明显统计学差异(P=0.240.41),提示与rs762551位点A基因型携带者相比,rs762551位点CC基因型可一定程度预防膀胱癌患者病情恶化进展。8.受试者口服咖啡因4 h后,高效液相色谱法测定不同受试组人群血清中咖啡因及其代谢产物浓度,采用1,7二甲基黄嘌呤与咖啡因的比值来表示CYP1A2 的活性,结果显示CYP1A2 rs762551位点CC、CA及AA组CYP1A2平均活性为分别为(2.91±1.09)、(3.27±1.24)和(4.68±2.35),与 CC组相比,AA组CYP1A2平均酶活性提高了 60.8%,提示CYP1A2 rs762551位点AA基因型可增强个体CYP1A2酶活性。9.使用不同浓度的AαC(0、20、40、60、80 μg/mL)对处理SV-HUC-1细胞24 h后测定细胞存活率,结果显示SV-HUC-1细胞存活率与AαC处理浓度表现为剂量依赖关系,伴随AαC处理剂量的增加,SV-HUC-1细胞存活率也不断降低。AαC 对SV-HUC-1细胞IC50为(55.43±3.98)μg/mL,为了明确AαC对SV-HUC-1细胞的可能影响途径,后续研究中我们选择20、40和60μg/mL AαC用于细胞处理。10.SV-HUC-1细胞分别给与20、40和60 μg/mL AαC干预6 h后,与对照组相比,20、40和60 μg/mL AαC可致SV-HUC-1细胞内ROS水平呈现不同程度增加,以上结果表明AαC可促进SV-HUC-1细胞内源性ROS的生成,产生应激效应。11.20、40和60 μg/mL AαC分别处理SV-HUC-1 细胞6 h后,测定SV-HUC-1细胞GSH/GSSG比率,与对照组相比,AαC处理组SV-HUC-1细胞GSH/GSSG比率降低(P0.05或P0.01),表明AαC处理可致SV-HUC-1细胞内GSH大量消耗,使GSSG过度累积,提示AαC可致细胞氧化应激程度增加。12.与对照组细胞相比,经20、40和60 μg/mL AαC处理后,SV-HUC-1细胞内8-OHdG水平显著增加,且伴随AαC作用剂量的增加,8-OHdG水平也逐渐递增,提示AαC处理可致SV-HUC-1细胞DNA损伤。结论1.CYP1A2基因rs762551位点单核苷酸多态性与膀胱癌发病风险具有明确的相关性。2.CYP1A2基因rs762551位点单核苷酸多态性与膀胱癌性别、年龄、病理分期等临床特征无明显相关性,但与膀胱癌患者病理分级相关。3.CYP1A2基因rs762551位点CC基因型携者与其它基因型相比,有着更长的PFS,但与短期复发没有显著相关性。4.本研究发现CYP1A2基因rs762551位点发生C→A突变后可增强CYP1A2酶活性,表现为1,7二甲基黄嘌呤与咖啡因比值的上调,且该促进作用仅发生于-163 A/A突变人群。可知CYP1A2基因rs762551位点单核苷酸多态性与膀胱癌风险相关性,可能与-163 A/A突变后CYP1A2酶活性增强,诱发促前致癌物激活,引发致癌物大量蓄积于膀胱组织有关。5.AαC对正常膀胱上皮细胞的基因毒性作用是通过氧化应激效应实现的,
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14

【相似文献】