Nrf2下调CTGF分泌和Wnt通路活化缓解肾间质疾病进展的机制探讨

发布时间：2020-06-04 17:46

【摘要】：目的:肾小管间质疾病是以肾小管间质为主要受累部位的一类疾病,其可表现为急性小管上皮细胞受损,随后损伤的上皮细胞出现异常损伤后修复,继而反复的损伤后修复导致肾间质细胞活化,进而发展至肾间质纤维化阶段。Nrf2-ARE信号通路能够调节机体氧化还原稳态,是机体对抗氧化损伤和药物毒性的最重要防御机制,此外其也参与应激后细胞周期的调控以及纤维化相关炎症因子的调节。鉴于Nrf2在细胞抗氧化应激、自身细胞保护、损伤后细胞周期调节、以及炎症反应中的起到重要调节作用,我们探索Nrf2是否参与肾间质疾病发生发展的多个环节,明确其在肾间质疾病发生发展中的作用,进而为临床工作中肾间质疾病的治疗提供新的思路以及理论依据。本课题组利用Nrf2基因敲除小鼠,采用经典肾间质纤维化模型-单侧输尿管结扎模型(UUO),选取造模后的不同的时间点,检测Nrf2表达情况及其调节作用。本课题拟探究Nrf2在肾间质疾病不同阶段,包括急性损伤,损伤后修复以及慢性纤维化阶段,的表达水平变化情况。并探究Nrf2基因缺失是否可以加重急性损伤,干扰损伤后修复以及影响慢性期纤维化发生等由急性至慢性转归病理改变。结缔组织生长因子(CTGF)是参与机体组织创伤修复过程的生长因子,其下游可活化Wnt通路,上调肾小管上皮细胞损伤后异常增殖,以及促进成纤维细胞的活化。我们在肾小管上皮细胞系中探讨Nrf2是否通过调节CTGF表达进而影响肾间质疾病急性至慢性发展。本研究旨在解析Nrf2在肾间质疾病中的作用机制,探索Nrf2是否可以成为肾间质疾病的临床治疗新的干预靶点,为Nrf2调节剂的临床应用提供理论依据。研究方法:1.利用野生型C57/B6小鼠,施行UUO手术,分别在术后2,5,14和21天收取肾脏组织。一部分用于提取蛋白质及RNA行分子生物学检查,后利用Western blot和RT-qPCR技术分析Nrf2-ARE信号通路中Nrf2、Gclc和Ho-1分子的表达,以期明确模型不同阶段肾组织中Nrf2以及下游基因的表达情况。另一部分用于病理包埋切片,行PAS病理染色以及Nrf2免疫组化染色,旨在明确Nrf2高表达部位,以及发现小管损伤部位与Nrf2高表达部位之间的关系,二者是否同一部位。同时行RT-qPCR检测动态分析E-cadherin,Vimentin,Fibronectin和α-SMA表达,结合PAS染色为第2部分研究选取合适的研究时间点提供依据。最后收集急性、亚急性和慢性肾间质疾病临床肾活检组织病理切片,行PAS和Masson病理染色以及Nrf2免疫组化染色,再次在人病理组织中验证Nrf2在不同阶段肾间质疾病中表达情况。2.利用Nrf2基因敲除小鼠,施行单侧输尿管结扎手术,分别在术后2,5,14天收取肾脏组织,分析Nrf2在间质疾病急性、亚急性以及慢性阶段的作用。在术后2天利用Westernblot技术检测凋亡指标(C-caspase3和PARP),并利用PAS染色以及TUNEL染色明确病理损伤,后对PAS染色行小管损伤评分以及TUNEL染色定量。在术后5天利用Westernblot技术以及免疫荧光技术检测细胞增殖指标PCNA以及转分化指标Vimentin。在术后14天利用Westernblot技术以及免疫染色分析间质纤维化指标(Fibronectin和α-SMA)表达。在UUO术后不同时点利用RT-qPCR技术分析Nrf2缺失对抗氧化反应相关基因以及炎症基因表达的影响。并根据炎症相关基因动态分析,选取14天为时间点,利Westernblot技术以及免疫染色分析巨噬细胞标志物F4/80的表达情况。3.在Nrf2基因敲除小鼠以及Nrf2沉默的肾脏小管上皮细胞系(NRK52E)中,分析小管上皮细胞中Nrf2对CTGF表达情况的调节作用。首先在UUO术后5天的肾脏组织中,利用免疫染色、Westernblot以及RT-qPCR方法检测CTGF表达水平。在NRK52E细胞中应用脂质体转染沉默技术建立Nrf2沉默的细胞模型,给予5%乏氧处理模拟间质肾间质疾病急性至慢性转化的重要危险因素,检测Nrf2基因沉默对CTGF表达水平和Wnt通路活化程度的影响。后在NRK52E细胞中应用脂质体转染沉默技术建立Nrf2以及CTGF双沉默的细胞模型,在上述乏氧处理条件下,检测Wnt通路相蛋白p-Lrp6和β-catenine的表达,旨在分析Nrf2沉默对Wnt通路活化是否依赖于CTGF的高表达。最后探索Nrf2对CTGF相关转录水平和转录后水平的调控的影响。在Nrf2基因沉默的情况下,检测CTGF转录调控因子c-fos及其磷酸化形式的表达和转录后调控小RNA(mir26a、mir26b、mir30a以及mir133a)表达水平。结果:1.Westernblot结果显示UUO术后肾脏组织中Nrf2蛋白表达水平显著高于对照组。其表达水平在UUO术后第2天开始升高,14天达到峰值,后表达水平下降。UUO组中受Nrf2调控的Gclc和Ho-1的表达水平也明显高于对照组织。连续切片进行PAS染色以及Nrf2免疫染色示Nrf2高表达位于损伤肾小管。与Westernblot结果一致,免疫组化结果示Nrf2在UUO术后第2天开始出现阳性表达,且存在细胞核阳性表达,在UUO术后14天阳性表达区域最多,以细胞质表达为主。E-cadherin,作为急性损伤指标,在UUO术后第2天表达显著下降。Vimentin,作为小管上皮细胞转分化指标,在UUO术后第5天开始升高,后持续高表达。UUO术后第14天,Fibronectin和α-SMA表达水平达到峰值。收集临床急性、亚急性、慢性肾间质病以及癌旁组织标本(作为对照)各3例,其中,男13例,女3例,平均年龄53.56岁,Nrf2免疫组化染色显示间质疾病组织中Nrf2的表达明显高于对照组织,且在急性间质病标本中Nrf2表达水平最高,且有明显细胞核阳性染色。2.UUO模型术后第2天,Nrf2基因缺失上调凋亡指标(c-caspase3和c-PARP)表达水平,加重PAS染色小管损伤程度和增加TUNEL染色阳性表达。与野生型小鼠相比,在UUO术后第5天Nrf2基因缺失小鼠的肾脏组织中细胞增殖修复指标PCNA以及转分化指标Vimentin高表达。在UUO术后第14天,Nrf2基因敲除小鼠肾组织呈现高表达的纤维化标志物Fibronectin和α-SMA以及巨噬细胞标志物F4/80。RT-qPCR结果显示,抗氧化相关基因Gclc、Ho-1和Nqo1在UUO术后2,5和14天呈高表达水平,但Nrf2基因缺失下调抗氧化相关基因的高表达。同时在UUO术后5和14天出现炎症相关促纤维化因子(IL6、IL1β、Tnf和Tgfβ)高表达,Nrf2基因缺失促进炎症相关促纤维化因子进一步高表达。3.Westernblot以及RT-qPCR结果显示,在UUO术后第5天,CTGF表达明显升高,且Nrf2缺失进一步促进CTGF高表达。CTGF免疫染色显示其高表达部位主要位于肾小管上皮细胞。在NRK52E细胞中Nrf2沉默后给予乏氧处理,Westernblot以及RT-qPCR结果提示上皮细胞转分化指标高表达,同时CTGF及Wnt通路相关基因(p-Lrp6和β-catenine)高表达。Nrf2与CTGF双基因沉默后下调Wnt通路相关基因及转分化指标Vimentin表达水平。Nrf2沉默可上调CTGF转录调节因子cfos及其磷酸化形式的表达水平,但Nrf2对CTGF转录后调节小RNA(mir-26a、mir-26b、mir-30a和mir-133a)无显著调节作用。结论:1.Nrf2及其下游基因在肾间质疾病中处于高表达状态,并呈现动态变化,急性期开始升高,存在核表达,随着肾间质疾病慢性化其表达水平逐渐降低;2.Nrf2对间质疾病急性损伤,损伤后修复以及间质纤维化形成有保护作用;3.在小管间质疾病急慢性阶段,Nrf2分别通过调节氧化应激以及炎症相关基因发挥其肾间质疾病的保护作用;4.Nrf2可抑制CTGF的转录进而下调Wnt通路的活化水平,从而调节肾间质疾病急性至慢性转化。
【图文】：

照片,肾脏病理,PAS染色,肾组织

3.1 UUO小鼠模型相关基础数据UUO术后肾脏大体标本照片可见随着术后时间逐渐延长，肾脏皮质逐渐变薄，失去原有实质脏器形态。PAS染色可见随着术后天数增加肾脏皮质逐渐变薄，术后2天示小管上皮细胞刷状缘脱落，，小管上皮细胞空泡变性以及小管官腔扩张；术后第5天可见部分小管腔的持续扩张以及部分小管上皮细胞肿胀；术后14天可见间质细胞浸润，小管间质扩张和肾脏皮质变薄；术后21天示肾脏皮质进一部变薄，间质成分增多和肾脏固有结构改变（图3.1.1）。肾脏脏器系数（病侧肾脏重量与心脏比值）呈先上升后下降趋势，术后2天肾脏脏器系数高于对照组，术后5天开始下降，14-21天肾脏脏器系数均低于对照组。UUO术后2-21天，E-cadherin,Vimentin, Fibronectin以及α-SMA的mRNA表达水平动态变化示：E-cadherin在术后2天下降，后持续呈低表达趋势；Vimentin表达在术后第5天开始上升后持续呈现高表达趋势；Fibronectin和α-SMA在术后14天后持续呈现高表达趋势（3.1.2）。

脏器系数

图 3.1.2 UUO 术后脏器系数和 E-cadherin, Vimentin 和 Fibronectin 的动态表达变化A：肾脏脏器系数（手术肾脏/心脏比值）；B：E-cadherin, Vimentin, Fibronectin 以及 α-SMA 的mRNA 表达水平动态变化。3.2 Nrf2 及 ARE 下游基因在 UUO 模型肾组织中的表达Westernblot 显示 Nrf2 及 ARE 下游 Gclc 和 Ho-1 蛋白在 UUO 模型中肾组织中的表达明显高于假手术组肾组织，且经定量分析可见 Nrf2 在 UUO 术后第 5 天开始升高，14 天达到峰值，21 天表达水平回落。而在 UUO 模型组织中，Nrf2 下游基因Gclc 和 Ho-1 在蛋白质和基因水平上同样呈上升趋势，但其从术后第 2 天便有明显增高趋势，早于 Nrf2 蛋白变化（图 3.2.1-2）。图 3.2.3 中图示如下：高低倍镜对应的相同位置由⊙符号指示，黑色箭头指示阳性细胞核表达，红色箭头指示阳性细胞浆表达。在 A3-E3 中,“+”指示尚完好小管； “*”指示存在刷状缘脱落和小管上皮细胞
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】