Gpr97在急性肾损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-09 15:53

【摘要】：急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是表现为肾脏功能突然下降,血液中含氮废物持续累积的严重临床综合征。多种疾病可以诱发AKI,包括心脏手术、脓毒血症和尿路梗阻等。尽管AKI的病理生理学机制被逐渐阐明,但是,临床上仍然没有治疗AKI的有效药物。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族是最大的一类跨膜受体家族,由于其位于细胞膜表面便于成药并调控多种生理功能,是临床上超过30%药物的靶点。但是,大多数GPCR的病理及生理学作用尚不清楚,仍有待被进一步研究。因此,深入探究在AKI发病过程中起关键作用的GPCR,发现针对GPCR的特异性配体,为临床AKI患者提供新的有效的治疗靶点具有重要意义。Gpr97属于孤儿粘附性GPCR家族成员,目前发现高表达于心、肾和骨髓,在免疫细胞表面也有表达,但Gpr97对免疫细胞的调节作用及机制仍然不清楚。有研究表明Gpr97可以影响前体B-淋巴细胞的凋亡,Gpr97基因敲除鼠中成熟的B220+B细胞的数量明显减少。但也有报道指出Gpr97不影响B-淋巴细胞和T-淋巴细胞的成熟。在肥胖型小鼠模型中,Gpr97基因敲除小鼠脂肪组织中M1型巨噬细胞浸润减少,M2型巨噬细胞浸润增加。这提示我们Gpr97具有明显的致炎作用。但在同种模型小鼠的肝脏和肾脏中,Gpr97并未表现出相同的致炎作用。同时,Gpr97在肾脏缺血再灌注损伤以及顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型中表达显著上调。因此,深入探讨Gpr97在AKI中的作用及机制具有十分重要的意义。研究目的1探究Gpr97在急性肾损伤中的表达模式,明确Gpr97是否参与急性肾损伤。2探讨Gpr97在急性肾损伤发生与发展过程中的作用。3研究Gpr97加重急性肾损伤的作用机制。研究方法第一部分Gpr97在肾脏缺血再灌注损伤中的作用1 Gpr97在急性肾脏缺血再灌注损伤模型中的表达变化1.1 琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)、蛋白质免疫印迹(western blot,WB)实验技术,检测Gpr97在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髓中的表达情况。体外培养肾脏实质细胞,检测Gpr97在肾脏实质细胞中的表达情况。1.2选取WT雄性小鼠,建立肾脏缺血再灌注损伤动物模型,检测Gpr97的表达变化情况。1.3取急性肾小管坏死(acute tubual necrosis,ATN)病人的肾活检标本,IHC检测Gpr97在急性肾小管坏死病人肾脏组织中的表达变化。1.4免疫荧光(immunofluoresce,IF)检测Gpr97在肾脏组织中的表达分布情况。1.5体外模拟低氧环境,WB检测Gpr97在NRK-52E细胞中的表达变化情况。通过三种方法建立体外低氧模型:37℃条件下,低氧(0.1%02)培养NRK-52E细胞90min(Oxygen-glucose deprivation,OGD)后,更换完全培养基正常培养;抗霉素A/2-脱氧葡萄糖(antimycinA(AA,10 μM)/2-deoxyglucose(2-DG,25 mM))阻断细胞氧化呼吸60min,更换完全培养基正常培养;氯化钴(CoCl2)造成低氧环境,连续刺激细胞 12h。2 Gpr97在急性肾脏缺血再灌注损伤模型中的功能探究选取雄性 WT、Gpr97 缺失型(Gpr97-/-)(B6.129-Adgrg3tm1Smoc)小鼠,构建肾脏IRI模型。检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组血清中肌酐和尿素氮的含量。苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)技术检测肾脏组织损伤和细胞死亡情况。Real-time RT-PCR检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾组织中促炎因子的表达变化情况。IF检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾脏组织切片中性粒细胞和巨噬细胞标记蛋白的染色情况,对比炎性细胞的浸润情况。第二部分Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重肾脏缺血再灌注损伤1 Gpr97对Sema3A蛋白表达的影响1.1使用基因芯片技术检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾脏Semaphorin家族的表达变化情况。Real-time RT-PCR技术检测不同组小鼠组肾脏组织Sema3A的mRNA水平。WB检测不同组小鼠肾脏组织Sema3A的蛋白水平。IHC技术在肾脏组织进一步确定Sema3A的表达变化情况。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同组小鼠血清中Sema3A蛋白的含量,并与肌酐尿素氮在血清中的含量进行相关性比对分析。1.2在NRK-52E细胞中,基因沉默Gpr97同时加入外源性Sema3A重组蛋白,ODG刺激细胞。检测细胞中炎症因子、细胞凋亡、Caspase-3活性以及Sema3A信号通路相关蛋白的表达变化。2 Gpr97通过影响HuR蛋白的表达对Sema3A进行转录后调控2.1检测Gpr97对RNA结合蛋白HuR的调控作用。动物水平,WB检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及IRI组肾脏组织中HuR蛋白的表达变化。细胞水平,WB检测Scramble与siRNA-Gpr97 Control组以及OGD组NRK-52E细胞中HuR蛋白的表达变化。IF检测基因沉默Gpr97后,OGD条件下NRK-52E细胞中HuR的表达及转位情况。2.2检测HuR对Sema3A的表达调控作用。Real-time RT-PCR检测基因沉默HuR后,NRK-52E细胞中Sema3A mRNA半衰期的变化情况。WB检测基因沉默Gpr97并加入HuR过表达腺病毒对OGD条件下NRK-52E细胞中Sema3A蛋白表达的影响。3检测HuR对Sema3A mRNA稳定性的影响通过序列比对,分析不同种属Sema3A mRNA 3 'UTR区ARE序列的分布情况。通过RNA-EMSA实验检测Sema3A mRNA与HuR蛋白的结合情况。双荧光素酶报告基因验证HuR对Sema3A mRNA稳定性的作用。第三部分Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究1 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的表达变化动物水平,选取12周龄WT、Gpr97-/-雄性小鼠,腹腔注射顺铂,诱导AKI动物模型。检测Gpr97的表达变化。细胞水平,加入顺铂刺激,WB检测Gpr97蛋白表达的变化。2 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的作用检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及AKI组血清中肌酐和尿素氮含量的变化、肾脏组织损伤情况、促炎因子的表达变化情况、炎性细胞的浸润情况。3 Gpr97通过影响Sema3A信号通路加重顺铂诱导的急性肾损伤Real-time RT-PCR、WB技术检测WT与Gpr97-/-小鼠Sham组以及AKI组肾脏组织Sema3A的表达水平。ELISA检测血清中Sema3A的含量。研究结果第一部分Gpr97在肾脏缺血再灌注损伤中的作用1 Gpr97在肾脏缺血再灌注模型中表达显著上调1.1琼脂糖凝胶电泳和WB结果显示Gpr97在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓中均有表达,且在心脏、骨髓和肾脏中呈现高表达;Gpr97在肾脏实质细胞中均有表达且在肾小管上皮细胞中呈现高表达。1.2对WT小鼠进行造模,基因芯片技术、WB、Real-timeRT-PCR和IHC结果显示,Gpr97在小鼠肾脏IRI模型中表达显著上调。进一步通过IHC检测发现在临床ATN病人肾活检组织中,Gpr97表达显著上调,且在损伤部位上调明显。IF结果显示,Gpr97主要定位在近曲小管和远曲小管。1.3培养NRK-52E细胞,不同方法建立体外低氧环境,检测Gpr97的表达变化情况。WB结果显示,Gpr97在三种刺激(OGD,AA/2-DG,CoC12)诱导的体外低氧模型中表达显著上调。2 Gpr97基因敲除明显减轻小鼠肾脏IRI选取雄性WT、Gpr97-/-小鼠,建立小鼠肾脏IRI模型,研究Gpr97的作用。结果显示相比WT组,Gpr97基因缺失,降低血清中肌酐、尿素氮的含量。HE结果显示,Gpr97-/-小鼠肾脏组织损伤情况较轻,形态学评分与WT组有显著性差异。TUNEL结果显示,Gpr97减少肾脏组织细胞的死亡,TNUEL阳性细胞数与WT组相比明显减少,并有统计学差异。Real-timeRT-PCR结果表明Gpr97-/-小鼠肾组织匀浆中促炎因子的表达量明显下调,炎性细胞的浸润明显减少。第二部分Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重肾脏缺血再灌注损伤1 Gpr97基因沉默抑制Sema3A的蛋白表达1.1选取雄性WT、Gpr97-/-鼠,建立肾脏IRI模型,结果显示,Gpr97基因缺失减少Sema3A蛋白的表达。ELISA显示,IRI后Gpr97-/-小鼠血清中Sema3A的含量较WT小鼠明显降低,且与肌酐尿素氮含量呈正相关。1.2检测在体外模拟低氧环境时,Gpr97的表达变化情况,检测Gpr97基因沉默的保护作用与Sema3A的关系。实时RT-PCR结果表明Gpr97基因沉默可以明显降低OGD条件下NRK-52E细胞中炎症因子表达。流式细胞术结果显示,Gpr97基因沉默可以明显减少OGD后肾小管上皮细胞的死亡,减少细胞中活化的Caspase-3蛋白。WB结果显示,Gpr97基因沉默可以显著上调Stat3的磷酸化水平,增加Survivin的表达。加入Sema3A重组蛋白,逆转了这一作用。进一步证实,Gpr97基因沉默可以减轻OGD引起的炎症反应和细胞死亡,而这一作用至少是部分通过介导Sema3A信号通路产生的。2 Gpr97通过影响HuR蛋白的表达对Sema3A进行转录后调控2.1 Gpr97基因缺失明显降低IRI后小鼠肾脏中HuR蛋白的表达水平,降低OGD后NRK-52E细胞中HuR蛋白的表达水平,同时减少HuR的胞浆转位。基因沉默HuR降低了细胞中Sema3A的蛋白表达,缩短了 Sema3AmRNA的半衰期。Gpr97缺失减少Sema3A蛋白的表达。外源性HuR过表达腺病毒的加入则逆转了这一作用。表明,Gpr97调控HuR进而调控Sema3A的表达。2.2基因序列比对结果显示,不同种属Sema3AmRNA3'UTR区均有ARE序列,且高度保守。RNA-EMSA结果显示,HuR可以与Sema3AmRNA结合,Gpr97基因沉默减弱了这一结合。双荧光素酶实验结果表明,HuR可以与Sema3AmRNA结合,调控其稳定性。第三部分Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究1 Gpr97在顺铂诱导的急性肾损伤模型中表达升高选取WT小鼠,腹腔注射顺铂,诱导AKI模型。实验结果显示,Gpr97在顺铂诱导的AKI小鼠肾脏组织中表达增加。细胞水平,加入顺铂刺激后Gpr97蛋白表达明显上调。2 Gpr97基因敲除明显减轻顺铂诱导的急性肾损伤选取雄性WT以及Gpr9-/-小鼠,建立顺铂诱导的AKI模型,检测Gpr97在顺铂诱导的AKI中的作用。结果显示,相比WT组Gpr97-/-小鼠在顺铂诱导的AKI模型中,肌酐、尿素氮的升高得到了抑制。HE结果显示,Gpr97-/-小鼠肾脏组织损伤情况较轻,形态学评分与WT组有显著性差异。Gpr97基因缺失导致肾脏组织匀浆中促炎因子的表达量明显下调,炎性细胞的浸润明显减少。3 Gpr97通过调控Sema3A信号通路加重顺铂诱导的急性肾损伤选取雄性WT以及Gpr97-/-小鼠,建立顺铂诱导的AKI模型,检测Gpr97在顺铂诱导的AKI中对Sema3A信号通路的影响。Gpr97-/-小鼠在顺铂诱导的AKI模型中,肾脏Sema3A蛋白水平较WT小鼠明显降低。AKI后Gpr97-/-小鼠血清中Sema3A的含量较WT小鼠明显降低。研究结论与创新性1本研究首次证实Gpr97在AKI疾病模型中表达显著上调,进一步研究发现Gpr97基因缺失明显减轻由AKI引起的肾脏损伤。为设计和开发以Gpr97为药靶针对AKI的药物,提供了重要的实验基础。2本研究发现Gpr97可以调控Sema3A蛋白的表达,进而证明了 Gpr97的肾脏保护作用至少是部分依赖于Sema3A信号通路。有助于进一步阐明GPCR在AKI中的作用,并提出针对GPCR设计药物进行疾病干预的可能性。3本研究进一步发现Gpr97是RNA结合蛋白HuR的上游调控蛋白,可以调节HuR的表达以及胞浆转位,进而通过HuR对Sema3A进行转录后调控。
【图文】：

结果逡逑１邋Ｇｐｒ９７在小鼠不同组织以及肾脏实质细胞中的表达情况逡逑琼脂糖凝胶电泳（图１Ａ）以及ＷＢ邋（图１Ｂ）结果显示，Ｇｐｒ９７在小鼠心、肝、逡逑脾、肺、肾、脑、骨髓中均有表达。在心脏、骨髓和肾脏中高表达。在肾脏实质细胞中，，逡逑琼脂糖凝胶电泳（图１Ｃ）以及ＷＢ邋（图１Ｄ）结果显示Ｇｐｒ９７表达于肾小管上皮细胞逡逑（ＮＲＫ－５２Ｅ）、系膜细胞（ＲＭＣ）、内皮细胞（ＧＥＮＣ）以及足细胞（ＭＰＣ），并且在逡逑ＮＲＫ－５２Ｅ中呈现高表达。逡逑／／／／／／＃邋／／／／／／＃逡逑Ｇｐｒ９７——５９ｋＤａ逡逑ＧＡＰＤＨ￣￣２ｍ２｜２｜Ｊ２Ｊ２Ｊ２｜２Ｊ２ｊ｜邋Ｇａｐｄｈ—逦—３７＿逡逑！邋Ｌｉｌｌ逦ｌｌｕｌｉｌ逡逑Ｃ逦Ｘ；邋ｒ邋＾逦Ｄ邋＾邋ｒ逦ｒ逡逑Ｇｐｒ９７—Ｇｐｒ９７邋—逦＾邋—５９ｋＤａ逡逑ＧＡＰＤＨ－ＵＪ２２３３Ｓ邋ＧＡＰＤＨ￣ｊ＾ＢＭｊｊｆｃｉＭ＞ｉ—ＨＨ｜ｉ？邋３７ｋＤａ逡逑３邋１逦４邋－逡逑图１邋Ｇｐｒ９７在小鼠不同组织及肾脏实质细胞中均有表达。Ａ琼脂糖凝胶电泳检测小鼠逡逑各器官中Ｇｐｒ９７的ｍＲＮＡ水平及统计分析（ｎ＝８）。Ｂ邋ＷＢ检测小鼠各器官中Ｇｐｒ９７的逡逑蛋白水平及统计分析（ｎ＝８）。Ｃ琼脂糖凝胶电泳检测肾脏各个细胞系中Ｇｐｒ９７的ｍＲＮＡ逡逑水平及统计分析（ｎ＝６）。Ｄ邋ＷＢ检测肾脏各个细胞系中Ｇｐｒ９７的蛋白水平及统计分析逡逑（ｎ＝６）0逡逑３４逡逑

２．２急性肾小管坏死患者肾活检样本中Ｇｐｒ９７的表达变化逡逑为确定Ｇｐｒ９７在ＡＫＩ病人肾脏中的表达变化，我们通过ＩＨＣ的方法，检测了临床逡逑ＡＴＮ病人（图２．２）肾活检标本中Ｇｐｒ９７的表达以及分布。结果显示，ＩＲＩ以及ＡＴＮ组逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

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本文编号：2704912