DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的作用及机制
发布时间：2020-06-09 22:53
【摘要】：肾小球疾病(glomerular diseases,GD)是一组累及双侧肾小球的肾脏疾病,是我国慢性肾衰竭的常见病因。尽管不同肾小球疾病的病因、病理分型、临床分类及预后各不相同,大量蛋白尿的出现是肾小球疾病患者重要的临床表现。在慢性肾脏疾病中,蛋白尿不仅是肾小球疾病的重要表现形式,更是肾脏疾病进行性加重、恶化的因素之一。足细胞(podocyte)是维持肾小球内环境稳态的重要组成部分,与肾小球内皮细胞和基底膜共同组成了肾小球滤过屏障,足细胞损伤可引起肾小球滤过屏障的破坏,产生蛋白尿,最终加重肾脏损伤。因此,寻找参与肾小球疾病足细胞损伤相关的关键分子,通过改善足细胞损伤而减轻蛋白尿,是当前肾脏疾病治疗的重要手段之一,也是对疗效进行判断的重要指标。甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DGKs)是体内肌醇磷脂信号系统的调节因子,生理情况下通过磷酸化甘油二酯(diacylglycerol,DAG)为磷脂酸(phosphatidicacid,PA)来调节细胞的功能活动。由于其底物(甘油二酯)和产物(磷脂酸)均为生物体内重要的信号分子,因此DGKs具有重要的生物学功能。目前在哺乳动物体内发现了 10个DGK家族成员,分属于5个亚类。除了共有催化结构域和Cl结构域外,他们的分子结构以及分布不同,生物学功能亦有所不同。甘油二酯激酶E(DGKE,DGKEε,DGK5)是III亚类中唯一的成员,与其它成员相比,其结构最简单,且具有花生四烯酸甘油二酯(AA-DAG)的底物特异性,这些特点提示我们DGKE可能在生理和病理条件下发挥与其他家族成员不同的作用。新近的临床研究表明,在非典型性溶血性尿毒综合征(atypical hemolytic urermic syndrome,aHUS)和肾小球微血管病变等蛋白尿相关肾脏疾病中出现了 DGKE功能缺失性的基因突变,说明DGKE已成为研究肾脏疾病的重要靶标。但是目前关于DGKE在肾脏疾病中的研究多集中在临床基因多态性检测方面,缺乏系统的实验性研究。研究目的本课题将通过使用足细胞条件性基因过表达动物和体外培养的足细胞,建立嘌呤霉素氨基核苷和阿霉素肾病两种肾小球疾病足细胞损伤模型,研究DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的作用,并初步探讨其发挥作用的分子生物学机制。1.探究DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的表达变化。2.明确DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的作用。3.探讨DGKE在肾小球疾病足细胞损伤的作用机制。研究方法与结果1.DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的表达变化选取8-12周龄雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠,实验室条件下适应性喂养一周后随机分为正常对照组和模型组。动物麻醉后尾静脉注射剂量360mg/kg 的嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)和 15mg/kg的阿霉素(adriamycin,ADR)分别构建两种肾小球疾病足细胞损伤模型。应用Real-time PCR、蛋白免疫印迹法(western blot,WB)、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光(immunofluorescence,IF)等方法,检测DGKE在肾皮质中的表达变化。结果显示与对照组相比,DGKE在两种肾小球疾病足细胞损伤模型肾皮质中表达明显降低。体外培养人源足细胞(human podocyte,HPC),分别使用PAN和ADR进行处理,结果显示,与正常对照组相比,PAN和ADR处理下足细胞中的DGKE表达显著降低。2.DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的作用构建DGKEflox/flox小鼠,与Podocin-Cre小鼠杂交,通过Cre-Lop技术获得特异性肾脏足细胞DGKE基因过表达小鼠(Podocin-Cre/DGKEflox/flox),以适龄的基因型为Podo-Cre-/DGKEflox/flox的小鼠作为对照,分别构建两种肾小球疾病足细胞损伤模型。通过PAS染色和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察小鼠肾小球形态和足细胞的超微结构。结果显示,与对照组相比,足细胞特异性过表达DGKE组肾小球疾病模型动物肾小球系膜基质增生和肾小球硬化现象明显减少,且足细胞中足突的融合、脱落程度亦显著减轻。使用免疫荧光法标记足细胞结构蛋白Nephrin和Podocin,结果显示,与对照组相比,足细胞特异性过表达DGKE可部分纠正肾小球疾病模型动物足细胞中结构蛋白Nephrin和Podocin的降低。体外培养人足细胞,转染携带DGKE全长基因序列的腺病毒,结果显示,足细胞过表达DGKE可以显著降低PAN和ADR等肾毒性药物引起的细胞损伤以及结构蛋白的缺失。这些结果表明DGKE对肾小球疾病足细胞损伤具有保护作用。3.DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中的作用机制初探我们通过实时定量PCR和Western blot的方法发现肾小球疾病模型动物肾皮质中TRPC6的mRNA和蛋白水平显著高于对照组,而足细胞特异性过表达DGKE后可降低TRPC6的表达,且DGKE足细胞特异性过表达也可以降低由损伤引起的细胞内钙离子超载。说明DGKE对肾小球疾病足细胞损伤的保护作用可能与下调TRPC6的表达有关,但本研究中细胞内钙离子浓度的变化是否确实由DGKE对TRPC6的调控作用实现的尚需进一步研究证实。考虑到DGKE的激酶活性,我们也对足细胞特异性过表达DGKE动物的肾皮质进行了蛋白磷酸化质谱分析。结果显示,肾小球足细胞特异性过表达DGKE动物肾小球中卷曲螺旋蛋白37(coiled-coil domain containing 37,CCDC37)出现了丝氨酸磷酸化。进一步使用免疫共沉淀技术(Co-IP),我们发现DGKE与CCDC37之间确实存在相互作用。由于目前CCDC37蛋白的生物学功能尚不明确,DGKE对肾小球疾病足细胞损伤的保护作用是否与其对CCDC37的磷酸化调控有关有待于进一步研究。结论及创新性本课题首次通过条件性过表达模式动物结合体外转染技术,明确DGKE在肾小球疾病足细胞损伤中发挥保护作用,并初步探讨其作用机制。本研究将为肾小球疾病及其他足细胞损伤性肾脏疾病的病因研究和干预策略提供新的思路,具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。
【图文】：
山东大学硕士学位论文实验结果逡逑第一部分ＤＧＫＥ在肾小球疾病足细胞损伤中的表达逡逑１．嘌呤霉素氨基核苷肾病小鼠肾皮质的表征逡逑尿液离心后使用自动生化分析仪测定白蛋白和尿肌酐，，以尿白蛋白（ＵＡＣＲ）比值（图ｌａ）判定肾小球疾病模型是否成功。结果显示与正常比，ＰＡＮ处理组小鼠的尿白蛋白肌酐比值明显升高。进一步通过ＰＡＳ邋（图透射电镜（图ｌｃ）检测发现肾小球出现系膜X椛约白阆赴阃蝗诤系认窒蟆ｅ义
本文编号：2705374
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山东大学硕士学位论文实验结果逡逑第一部分ＤＧＫＥ在肾小球疾病足细胞损伤中的表达逡逑１．嘌呤霉素氨基核苷肾病小鼠肾皮质的表征逡逑尿液离心后使用自动生化分析仪测定白蛋白和尿肌酐，，以尿白蛋白（ＵＡＣＲ）比值（图ｌａ）判定肾小球疾病模型是否成功。结果显示与正常比，ＰＡＮ处理组小鼠的尿白蛋白肌酐比值明显升高。进一步通过ＰＡＳ邋（图透射电镜（图ｌｃ）检测发现肾小球出现系膜X椛约白阆赴阃蝗诤系认窒蟆ｅ义
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