RBM3的表达对前列腺癌细胞转录组学的作用：RNA测序研究

发布时间：2020-06-10 00:48

【摘要】：目的:前列腺癌在男性恶性肿瘤的发生率排名第二位,随着我国现代化进程的加速和人口老龄化的加剧,前列腺癌已经成为威胁我国男性健康的主要疾病之一。RNA结合基序蛋白3(RNA-binding motif 3,RBM3)是冷应激蛋白家族成员之一,近些年的研究发现RBM3的特异表达与包括卵巢癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、膀胱癌、结直肠癌以及前列腺癌在内的多种癌症的发生相关,因此认为其是一种潜在的癌相关基因,在促进细胞增殖和减弱细胞凋亡的过程中有重要作用,特别是与前列腺癌的发病机理密切相关。但是RBM3究竟在前列腺癌的发展中起到什么样的作用还存在着较大的争议。在本项研究中,我们试图用二代测序的技术手段在基因水平上对以上问题进行初步的探索。方法:1.构建RBM3敲减的前列腺癌细胞系,提取RNA并建立cDNA文库。2.利用高通量测序技术对细胞样本进行转录组测序,经过对原始测序数据的过滤和质量评估,筛选出基于RBM3基因变化引起的差异表达基因。3.通过GO基因注释、pathway信号通路分析及信号通路互作分析、差异基因互作网络分析揭示RBM3与前列腺癌的关系。4.通过RT-qPCR(实时荧光定量PCR)对测序结果进行验证分析,最终确定RBM3调节前列腺癌进展的关键差异基因。结果:1.转录组测序的结果发现RBM3敲减的前列腺癌细胞株PC3-siRBM3中有698个差异表达基因,其中446个基因上调,252个基因下调。2.基因功能注释及通路分析发现差异基因主要富集在脂质代谢、突触传递、G蛋白偶联受体、细胞膜去极化等条目中。3.通过pathway信号通路分析及信号通路互作分析发现,和脂质代谢相关的通路,如乙醚脂类代谢,亚油酸代谢,α亚油酸代谢是诸多信号通路的核心;和神经疾病或神经退化相关的通路,如谷氨酸能突触传递和伽马氨基丁酸突触传递也在网络中占据了显著的位置。4.通过差异基因互作网络及GO基因注释和pathway信号通路分析,我们发现脂质代谢相关通路中的差异基因与前列腺癌密切相关。磷脂酶A2家族中的基因被多次富集,如PLA2G2A、PLA2G2F、PLA2G4C、PLA2G3在两组细胞系中的表达水平差异最为明显(p值分别为PLA2G2A:0.0024,PLA2G2F:1.42×10~(-5),PLA2G4C:0.046,PLA2G3:0.018)。5.差异基因互作网络分析显示GNG5、EDN1、NOS3、GAL、ACE、CD38等拥有较高的基因节点个数,彼此间的作用关系密切,且和其他差异基因的作用广泛,在网络中属于核心基因。6.此外,GNG5和G蛋白偶联受体信号通路,EDN1和血管生成相关通路,CD38和信号转导通路,NOS3与一氧化氮合成途径,CYP2B6与药物代谢的关系,GAL与其受体的活化状态,ACE基因的多态性也与RBM3的调控密切相关。7.通过RT-qPCR实验对测序结果进行了验证,结果显示多数差异基因的变化和测序结果相符,测序结果的可信度较高。结论:我们通过转录组测序及生物信息学手段分析RBM3敲减对前列腺癌细胞株中基因的变化,并通过RT-qPCR实验对测序结果进行了验证。通过差异基因的筛选、生物信息学分析确定了与前列腺癌关系密切的基因,如PLA2G2A、PLA2G2F、PLA2G4C、PLA2G3等。而且发现了脂质代谢相关的通路是RBM3敲减后前列腺癌细胞中PC3-siRBM3显著变化的核心信号通路。这些发现提示我们RBM3可能是通过脂质代谢通路来调节前列腺癌进展的。RBM3还可能在神经疾病或神经退化的调节中与谷氨酸能突触和伽马氨基丁酸突触传递有着密切的关系。通过这些基因和通路可以对前列腺癌的发生发展作进一步的深入研究,为我们今后对RBM3的调节作用的研究提供了崭新的视角。
【图文】：

图 3.1 RBM3 在各株细胞中的表达情况A：RT-qPCR 实验中 RBM3 在各株细胞系中的表达情况，* p<0.05。 B：Western Blot 实验中RBM3 在各株细胞系中的表达。其中 PC3-R1 细胞系中，因为结合了 GFP 荧光物质，使得 RBM3的表达量不是内源性表达量 17kDa，而是约 42kDa （GFP 分子量 25kDa）。图中 PC3-siR1、PC3-siR2、PC3-siR3 三株细胞系的 RBM3 表达水平均较 PC3 下降且和 RT-qPCR 结果相符。3.2 总 RNA 质检及测序参数RNA 的质检列表见表 3.1，全部样品的 OD260/280 比值均在 1.8-2.1 之间，符合测序的基本要求；用于测序的两个样品的琼脂糖凝胶电泳图显示 RNA 的完整性较好，，可以用作后续的测序实验，见图 3.2。表 3.1 RNA 质量检测列表序号 样品 浓度（ng/μl） OD 260/280 OD260/230

si1(2) 564.7 si1(3) 571.4 si2(1) 550.3 si2(2) 564.7 si2(3) 488.9 si3(1) 560.2 si3(2) 539.3 si3(3) 471.1 siNC(1) 608.4 siNC(2) 587.5 siNC(3) 528.0
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25

【参考文献】

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1 Binhua P.Zhou;;Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis[J];癌症;2011年09期

本文编号：2705523