TRPV4通道在正常膀胱上皮细胞及膀胱癌细胞系表达差异的研究

发布时间：2020-06-11 12:09

【摘要】：研究背景:膀胱癌被报道是全身的十大常见肿瘤中之一,也是泌尿系统疾病中最常见的恶性肿瘤,在我国泌尿生殖系统肿瘤发病率占第一位。近几年随着各种不同的治疗手段的不断进步,各种手术方式及药物的应用使得膀胱癌的治疗策略越来越丰富,但是患有膀胱癌的患者的预后情况仍然不乐观,患者的5年存活率并没有得到显著的提高。膀胱肿瘤的病理类型主要为尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺癌,以及罕见病理分类如小细胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及转移性癌等。其中,绝大部分的膀胱肿瘤为尿路上皮癌,尿路上皮癌的发病率占所有膀胱肿瘤的90%。然而,至今其发生发展的相关机制尚未完全清楚,因此,研究其发生发展机制对于找到膀胱癌新的治疗靶点至关重要。瞬时感受器电位(Transient receptor potential,TRP)超家族是最早被发现于果蝇的视觉系统中的一类非选择性阳离子通道家族,广泛分布于低等及高等生物中,目前已发现30多个成员。依其结构同源性可分为TRPC(canonical)、TRPV(vanilloid)、TRPM(melastatin)、TRPA(ankyrin transmembrane protein)、TRPML(mucolipin)、TRPP(polycystin)、TRPN(nompC-like)7个不同的亚家族,每一亚家族又由若干成员组成。TRPV是其中最大、最多样化的重要亚家族,包括:TRPV1-6六个成员,可参与多种细胞功能的调节。瞬时感受器电位香草醛受体亚型4(TRPV4)于消化、呼吸、心血管等系统中广泛表达,TRPV4通道参与多种生理及病理过程,在功能上,TRPV4通道可被温度、剪切力、渗透压等刺激激活,以此参与对机体生理功能的调控。近年来,研究者发现多种TRP通道(TRRPV1,TRPM8,TRPC6等)的异常表达在促进或抑制多种肿瘤发生发展中发挥重要作用,TRP通道逐渐成为肿瘤研究的热点。但TRPV4在膀胱癌的发生发展发挥的作用鲜有报道,TRPV4在膀胱粘膜上皮有丰富的表达,生理情况下主要参与膀胱的机械感受,通道被激活后首先引起细胞内钙离子升高,细胞内钙离子是重要的细胞内第二信使,有研究表明,钙信号的改变参与膀胱癌的发生发展,因此,我们假设TRPV4通道异常表达可能在膀胱癌的发生发展中发挥作用。研究目的:通过比较TRPV4通道在正常膀胱上皮细胞及膀胱癌细胞系中的功能及蛋白表达差异,探究TRPV4在膀胱癌发生发展中的作用。研究方法:体外培养人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1,人膀胱癌5637,T24,J82,SW1710细胞系。在荧光显微镜下利用钙成像方法,以TRPV4通道激动剂GSK 1016790A激活TRPV4通道,记录这五种细胞系细胞内钙离子内流幅度及出现反应的细胞百分比,制作剂量效应曲线,得出半最效应浓度(EC50)及最大反应幅度值(Max)并比较各细胞系EC50及Max的区别,从而观察TRPV4通道功能表达的差异。以ATP激活尿路上皮嘌呤受体,观察记录这五种细胞系细胞活性有无差别。用免疫组化的方法观察在这五种细胞系及人膀胱癌旁组织与肿瘤组织中的TRPV4通道蛋白表达情况及差异。以方差分析及Dunn's检验统计各细胞系GSK引起的钙离子升高幅度的差异;以卡方检验统计对GSK出现反应的细胞百分比的差异。研究结果:细胞培养结果显示:在人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1及4种膀胱癌细胞系均可见各细胞均呈多边形生长,这提示了细胞已经进行了分化,且形态上无明显差异。钙成像结果显示:GSK对正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1、膀胱癌细胞系5637及T24细胞均引起了浓度依赖性的细胞内钙离子升高,EC50分别为38.25nM,1.29nM,0.97nM;钙内流最大幅度分别为1.39±0.02,0.40±0.08,0.63±0.03。但在膀胱癌细胞系SW1710及J82中任何浓度GSK刺激时均无细胞内钙离子升高,无法计算EC50及Max。以单一浓度30nMGSK刺激引起的细胞内钙离子升高幅度进行比较时,发现正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1细胞内钙离子内流升高幅度明显高于膀胱癌细胞系5637及T24,细胞内钙离子内流最大升高幅度分别为1.07±0.07,0.37±0.04及0.60±0.12,膀胱癌细胞系J82及SW1710无细胞内钙离子浓度无变化,正常细胞系与其它四种癌细胞系相比有明显差异(方差分析检验,P0.01),正常细胞系与其他各细胞系两两比较均显示差异(P均小于0.01);在30nMGSK刺激时,人正常上皮细胞系SV-HUC-1、膀胱癌细胞系5637、T24、SW1710及J82细胞发生钙内流反应的细胞百分比分别为52.20%,1%,25%,0及0,正常细胞系与其它四种癌细胞系相比有明显差异(卡方检验,P0.01)。以对ATP反应作为衡量细胞活性的指标,结果显示各细胞系对100uMATP的反应无明显差别(P0.05),证明各细胞对GSK引起的钙内流差异非细胞活性差别引起。免疫组化实验结果显示:这五种细胞系TRPV4通道受体蛋白均有不同程度的表达,但是与正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1相比,膀胱癌细胞系表达强度较弱,说明了在膀胱癌细胞系中TRPV4通道受体的蛋白表达较正常膀胱上皮细胞系降低。同时我们也进行了人膀胱癌旁组织与人肿瘤组织TRPV4通道蛋白表达情况的比较,也得到了相同的结果。研究结论:实验结果表明四种膀胱癌细胞系的TRPV4通道无论在功能表达水平还是蛋白表达水平均较正常膀胱上皮细胞系降低,提示TRPV4可能在膀胱癌的发生发展中起一定作用,TRPV4通道可能成为未来治疗膀胱癌的靶点。
【图文】：

膀胱癌细胞系,癌细胞系,图片,光镜

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑３．结邋果逡逑３．１邋．细胞系形态的比较逡逑下图各细胞培养时光镜图片，我们由图可见在人正常膀胱上皮细胞系逡逑ＳＶ－ＨＵＣ－１及４种膀胱癌细胞系均可见各细胞均呈多边形生长，这提示了细胞已逡逑经进行了分化，且形态上无明显差异。逡逑

细胞系,剂量效应关系,钙离子,浓度

为进？步显示各个细胞系对ＧＳＫ刺激的差异，选S谓咏０螂咨掀は赴义舷档模簦坑行ǘ龋牛茫担板澹ǎ常埃睿停┳魑冉希抵窒赴挡钜斓谋曜肌Ｔ冢常埃睿团ǘ鹊腻义希牵樱舜碳五种细胞系钙离Ｔ变化剂贵效应关系如图５Ａ，，细胞内钙离子内流最逡逑大升高幅度在正常膀胱上皮细胞系ＳＶ－ＨＵＣ－１、膀胱癌细胞系５６３７、Ｔ２４中别为逡逑１．０７±０．０７，０．３７±０．０４邋及邋０．６０＊０．１２，而邋ＧＳＫ邋１０１６７９０Ａ邋在邋Ｊ８２邋及邋ＳＷ１７１０邋膀胱癌逡逑细胞系未引起胞内钙离子浓度的变化，正常细胞系与其它四种癌细胞系相比有明逡逑显差异，经方差分析检验，Ｐ＜０．０１，，具有统计学意义。正常细胞系与其他各细逡逑胞系两两比较均显示差异（Ｐ均小于０．０１）。细胞发生钙内流反应的细胞百分比逡逑在人正常上皮细胞系ＳＶ－ＨＵＣ－丨、膀胱癌细胞系５６３７、Ｔ２４、ＳＷ１７１０及Ｊ８２细逡逑胞中分别为５２．２０％，邋１％，邋２５％，邋０及０，与细胞内钙离子变化幅度结果一致，经逡逑卡方检验，ＰＣ０．０１，具有统计学意义（表２）。各细胞系间幅度的比较可见正常逡逑膀胱上皮细胞系升高幅度较大（图５Ｂ）。各细胞系百分比的比较与钙内流升高逡逑幅度结果相同（图５Ｃ）。因此我们的实验表明ＴＲＰＶ４通道受体在激动剂３０ｎＭ逡逑ＧＳＫ的刺激T，正常膀胱上皮细胞系较膀胱癌细胞系发生钙内流细胞数量更多，逡逑钙内流幅度更大，且Ｐ＜０．０１，具有统计学意义。逡逑２３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14

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