YAP信号调节阿霉素肾病足细胞进入细胞周期及失分化

发布时间：2020-06-16 14:33

【摘要】：背景足细胞又称为肾小球脏层上皮细胞,覆盖在肾小球基底膜外侧,其相邻足突彼此交错,构成肾小球滤过膜屏障的关键组成部分。足细胞还具有合成基底膜成分,维持肾小球形态,调节肾小球血流等多种功能。很多肾小球疾病伴有足细胞损伤,导致细胞功能障碍或丧失,引起蛋白尿,严重的损伤导致足细胞数量减少,从而导致肾小球硬化和肾衰竭。足细胞是终末分化细胞,几乎没有增殖再生的能力,细胞周期抑制蛋白,包括p21,p27和p57的高表达是维持成熟足细胞低增殖能力的主要原因。目前有研究发现,在某些肾小球疾病如细胞型局灶节段硬化性肾小球肾炎、塌陷性肾小球病以及人类免疫缺陷病毒(HIV)相关肾病,足细胞会重新进入细胞周期,重新进入细胞周期的足细胞对致病化合物的易感性增加。目前关于足细胞在病理状态下重新进入细胞周期的具体分子生物学机制的研究甚少。Hippo通路是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链,活化的Hippo信号通过使得其下游效应分子Yes相关蛋白(YAP)磷酸化增加,从而对其转录活性起到负性调控的作用,它的主要作用是限制组织的过度生长,并维持细胞增殖和凋亡稳态。目前有关研究发现,YAP信号通路在足细胞凋亡中发挥了重要作用,而其在足细胞细胞增殖及分化方面的作用尚无研究报道,本实验拟通过体内外实验探讨YAP信号调节阿霉素诱导足细胞进入细胞周期及失分化中的作用。目的探讨YAP信号在阿霉素肾病足细胞进入细胞周期及细胞失分化中的作用及其调节机制。方法体内实验中,使用阿霉素肾病小鼠模型,考马斯亮蓝法检测小鼠尿液白蛋白,肌氨酸氧化酶法检测小鼠尿肌酐的水平。免疫组化染色检测小鼠肾脏PCNA、CDK4、Cyclin D1、YAP及Desmin的表达。免疫荧光染色检测小鼠肾脏足细胞标志蛋白Podocalyxin和Desmin、Snail2的共定位。本研究使用条件永恒的小鼠足细胞株5P12,15-25代分化的足细胞进行体外实验研究。流式细胞仪检测细胞周期,免疫荧光染色检测PCNA、P-YAP、CDK4、Snail2及Desmin的表达。过表达质粒转染上调足细胞YAP的表达。Real-time PCR检测细胞周期相关基因及足细胞标志基因和失分化相关基因的表达。Western blot检测蛋白质表达。结果阿霉素肾病小鼠在尾静脉注射阿霉素(10mg/kg)8天后尿白蛋白肌酐比值开始上升,其中第16天的尿白蛋白肌酐比值明显上升,为56.6±16.03(mg/mmol),与对照组4.05±0.44mg/mmol相比,p0.05。阿霉素肾病小鼠肾脏足细胞表达增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA),阿霉素刺激体外37°C培养的足细胞12h及24h之后,流式细胞仪检测显示足细胞进入细胞周期,其中进入S期的细胞比例分别为39.94±0.84%和41.18±1.46%,与对照组26.52±0.65%相比,p0.05。细胞免疫荧光染色发现,阿霉素刺激4h、8h及12h之后,PCNA的表达上调。阿霉素肾病小鼠在给建模16天后肾小球足细胞开始表达细胞周期相关蛋白CDK4和CyclinD1。体外阿霉素孵育对足细胞细胞周期相关蛋白基因的表达水平无明显影响。免疫印迹显示阿霉素孵育足细胞4h及8h后,细胞周期相关蛋白CDK4和CyclinD1明显上调,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P27和P21的表达无明显改变。进一步实验显示YAP信号可能在调节足细胞重新进入细胞周期中发挥作用,体外实验中予以阿霉素孵育足细胞4h和8h之后,磷酸化YAP的水平明显降低,12h之后恢复基线值,细胞免疫荧光染色同样证实这一结果。体内实验免疫组化染色发现,在阿霉素肾病小鼠肾脏中足细胞细胞核内YAP的表达明显增加。体外过表达足细胞内YAP发现可促进足细胞进入细胞周期,同时上调细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达。予以YAP/TEAD结合抑制剂维替泊芬可以减弱阿霉素引起的细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达上升,并同时减少进入S期细胞的比例。阿霉素孵育足细胞显示间充质细胞相关基因α-SMA、PAX2、snail、desmin的表达上调,而足细胞标志蛋白WT1及ZO-1基因表达下调,而对Synaptopodin及Podocalyxin的表达无明显影响。免疫印迹实验显示,阿霉素孵育后,足细胞内间充质细胞标记蛋白Snail2、Desmin的蛋白质表达上调,而紧密连接蛋白ZO-1的表达明显下降。免疫荧光染色显示,阿霉素小鼠肾脏组织Podocalyxin分别Desmin和Snail2存在共定位,免疫组化染色发现阿霉素小鼠肾脏足细胞存在CDK4和Desmin的共定位。体外使用成纤维细胞生长因子bFGF刺激分化成熟的足细胞,可使得足细胞重新进入细胞周期,并上调细胞周期相关蛋白CDK4和CyclinD1的表达。过表达足细胞内YAP可上调失分化相关蛋白Desmin和Snail2的表达。免疫荧光显示,bFGF刺激分化成熟的足细胞可使CDK4分别和Snail2、Desmin共染的细胞比例增加,上调失分化相关基因的表达。免疫印迹结果显示,bFGF刺激分化成熟的足细胞72h之后可明显下调足细胞相关标志蛋白WT1、Podocalyxin、Nephrin的表达,并使得失分化相关蛋白Desmin和Snail2的表达增加,此外细胞上清液中可发现Nephrin蛋白。结论阿霉素可引起足细胞CDK4和Cyclin D1表达增高,从而重新进入细胞周期,该过程至少部分通过YAP信号介导。进入细胞周期的足细胞表面分化的标志脱落入培养液,同时高表达间充质细胞的标记Desmin和Snail2,引起细胞失分化。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

细胞增殖核抗原,足细胞

图 1 阿霉素小鼠出现蛋白尿Figure 1：Adriamycin-induced proteinuria in mice注：*：与 control 组相比，P<0.051.3.2 部分受损伤的足细胞表达增殖核抗原PCNA 是增殖细胞核抗原，在 G0～G1 期细胞中无明显表达，在 G1 晚期，它的表达大幅度增加，在 S 期达到高峰，而 G2～M 期则明显下降，表达量的变化与 DNA 合成水平一致，因此，检测其在细胞中的表达，可以作为评价细胞进入 G1 期的一个重要指标。免疫组化染色发现，在阿霉素小鼠肾脏切片中可以看到足细胞中 PCNA 的表达，意味着在该动物模型中部分足细胞可能进入 G1 期，如图 2 所示。

足细胞,增殖细胞核抗原,阿霉素

上海交通大学医学院博士学位论文Figure 2：Partially damaged podocytes express cell proliferating nuclear antigen PCNA注：CON:control，箭头所指为足细胞，放大倍数为 400 倍1.3.3 阿霉素刺激分化的足细胞表达增殖细胞核抗原 PCNA在体外实验中，使用进行细胞免疫荧光，阿霉素 0.25ug/ml 刺激体外 37℃培养的足细胞发现，与 control 组相比，阿霉素刺激 4h、8h 及 12h 后，足细胞内增殖细胞核抗原 PCNA 的表达明显增加，进一步验证了动物实验的结果。

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