ETV6，miR-200家族，CRKL三者形成的调控环路对肾透明细胞癌转移能力的影响

发布时间：2020-06-21 16:25

【摘要】：背景:肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是常见的泌尿系中高发病率恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的2%-3%,其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常见的,也是最具侵略性的肾细胞癌,除手术治疗并没有其他有效的治疗方案,但术后患者的复发率高,约占20%-40%,因此研究ccRCC的发生和转移具有重大的现实意义。CRK是一类接头蛋白,最初作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要有SH2和SH3结构域组成。CRKL是CRK家族中的一员,在各个组织中广泛表达。最近研究表明:CRKL的异常表达与肿瘤生物学行为密切相关。然而对于CRKL与肾透明细胞癌发病机制及可能参与的信号通路的研究较少,值得进一步深入研究。MicroRNA(miRNAs)是一类包含21-25个碱基的单链非编码RNA。miRNAs通过与AGO2蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体,进而结合靶向基因的3’-UTR区引发靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程。miR-200家族包括miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-429,miR-141。研究发现其在多种癌症中作为肿瘤抑制因子参与调控肿瘤转移。而miR-200家族在肾癌中报道较少,值得深入研究。在TargetScan生物信息学软件上发现miR-200家族与CRKL存在潜在靶向关系,因此miR-200家族与CRKL的在肾透明细胞癌中的调控关系值得深入探究。ETV6,又称TEL,是转录因子ETS家族中的一员,在疾病的发展进程中有重要的作用。通过生物信息学软件分析,我们发现其能与miR-200家族的启动子区结合调控其转录。目的:1.CRKL表达水平与肾透明细胞癌,786-O,ACHN细胞的关系探究;2.miR-200家族与肾透明细胞癌关系探究;3.肾透明细胞癌中miR-200家族如何调控CRKL;4.肾透明细胞癌中ETV6如何调控miR-200家族和CRKL。方法:1.利用Lipofectamine~(TM)2000介导法转染miR-200家族mimic,以及阴性对照组NC-mimic,并用qRT-PCR检测转染效率;2.Transwell小室检测miR-200家族表达变化对786-O和ACHN细胞迁移侵袭能力的影响,WB检测EMT相关分子的表达变化;3.构建双荧光素酶载体psiCHECK-mut CRKL-site1,psiCHECK-mutCRKL-site2,psiCHECK-wtCRKL-site1,psiCHECK-wtCRKL-site2及psiCHECK-wtCRKL-site1+site2,检测miR-200家族对CRKL的靶向作用;4转染ETV6的小干扰序列si-ETV6,qRT-PCR检测miR-200家族的表达;5.转染si-ETV6后,Transwell检测786-O和ACHN细胞的迁移侵袭能力;6.转染si-ETV6后,WB检测CRKL和EMT相关分子的表达;7.CoIP,WB实验检测CRKL和ETV6是否能直接作用,探究三者之间的调控关系;8.qRT-PCR检测肾透明细胞癌临床样本中mi R-200家族,CRKL,ETV6的相对表达量,WB检测CRKL,ETV6,EMT相关分子的相对表达量。结果:1.786-O和ACHN细胞中转染mi R-200 mimic后能抑制其迁移侵袭能力,其中miR-429和miR-200c的作用抑制效果最明显;2.WB证明,786-O和ACHN细胞过表达miR-200分子后,能抑制CRKL的表达,并抑制CRKL/SOS1/Ras/Raf/MMP9信号通路,其中miR-429和miR-200c的抑制作用最明显;3.成功构建psiCHECK-mutCRKL-site1,psiCHECK-mut CRKL-site2,psiCHECK-wtCRKL-site1及psiCHECK-wtCRKL-site2双荧光素酶载体;4.双荧光素酶报告基因实验证明miR-429和miR-200c可以靶向调控CRKL3’-UTR区;5.ETV6下调后能促进miR-200家族的表达,抑制786-O和ACHN细胞的迁移侵袭能力;6.CoIP实验证明CRKL可以和ETV6直接作用,并发现转染si-CRKL后,能降低细胞核中CRKL-ETV6复合物的表达,调控miR-200家族的表达;7.WB实验证明在40例肾透明细胞癌临床样本中,CRKL和ETV6的蛋白水平高表达,qRT-PCR检测在26例肾透明细胞癌临床样本,miR-429和miR-200c低表达,与CRKL和ETV6的mRNA水平没有相关性,与CRKL和ETV6的蛋白水平负相关。结论:1.miR-200家族表达水平和786-O和ACHN细胞的迁移侵袭能力负相关;2.miR-200家族抑制CRKL的表达,抑制CRKL/SOS1/MMP9信号通路;3.miR-429和miR-200c能靶向调控CRKL3’-UTR区,并且两个靶向位点中CRKL3’-UTR 3728-3735区是主要靶向位点;4.ETV6下调促进miR-200家族表达水平,抑制786-O和ACHN细胞的迁移侵袭能力;5.CRKL可以和ETV6直接结合,调控mi R-200家族的表达;6.肾透明细胞癌临床样本中,ETV6和CRKL的蛋白水平高表达和miR-200c/429低表达负相关,ETV6和CRKL的蛋白水平和miR-200c/429家族水平负相关。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11
【图文】：

图 1-1：miR-200 家族与 CRKL3’UTR 区潜在的结合位点预测iR-200 家族过表达抑制 786-O 和 ACHN 体外迁移侵袭能力1）肾癌细胞 786-O 和 ACHN 中转染 miR-200 家族 mimic 24h 后检测其，如图 1-2-1 所示，在 786-O 细胞中，miR-200 家族 5 个成员表达水平000 倍以上（p＜0.001），具有统计学意义；在 ACHN 细胞中，miR-2 个成员表达水平都上升了 500 倍以上（p＜0.001），具有统计学意义。表明，转染 miR-200 家族 mimic 24h 后，miR-200 家族在 786-O 和 ACH上调，且 786-O 的转染效果更显著。转染成功，保障进一步实验。

图 1-1：miR-200 家族与 CRKL3’UTR 区潜在的结合位点预测2. miR-200 家族过表达抑制 786-O 和 ACHN 体外迁移侵袭能力（1）肾癌细胞 786-O 和 ACHN 中转染 miR-200 家族 mimic 24h 后检测其转染效率，如图 1-2-1 所示，在 786-O 细胞中，miR-200 家族 5 个成员表达水平上升了 1000 倍以上（p＜0.001），具有统计学意义；在 ACHN 细胞中，miR-200 家族 5 个成员表达水平都上升了 500 倍以上（p＜0.001），具有统计学意义。实验结果表明，转染 miR-200 家族 mimic 24h 后，miR-200 家族在 786-O 和 ACHN 中显著上调，且 786-O 的转染效果更显著。转染成功，保障进一步实验。

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本文编号：2724330