硫化氢通路在蛋白酶激活受体4相关膀胱疼痛中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-21 18:39

【摘要】：前言膀胱疼痛是泌尿外科最常见的内脏性疼痛,是间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)的典型表现。间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征是一种慢性非细菌性膀胱炎性难治性疾病,伴有下尿路症状(尿频或尿急),但不伴有明显的膀胱病理性改变。其严重影响患者的生活质量,尤见于女性,并且随着年龄增加,IC/BPS发病率也跟着增加。IC/BPS发病原因不十分明确,目前主要有三种观点:(1)膀胱上皮功能紊乱,导致膀胱上皮通透性或者敏感性增加;(2)膀胱及神经性炎症,典型的膀胱病理性表现为Hunner溃疡;(3)神经病理性疼痛,包括传入神经数量增多、大脑结构和功能改变、内源性抑制通路异常。由于发病机制不明确以及患者存在个体化差异,目前没有治疗IC/BPS的有效方案;治疗主要局限于保守性治疗,包括行为疗法、口服或者膀胱灌注治疗、膀胱水化扩张治疗,但是这些治疗常常失败或者只能短期内改善症状;其余治疗缺乏有效的临床证据,只能作为替代治疗。现在大量的研究表明膀胱传入神经元敏感性增加与疼痛敏感性增加或者痛觉超敏感有关。支配膀胱的盆腔和下腹部/腰部内脏神经Aδ和C-纤维不仅对机械刺激敏感,对化学刺激和温度刺激均敏感,尤其在致敏作用之后,这些神经分布在浆膜层、肌层、尿路上皮层,多种介质包括物质P(SP)、神经激肽A、降钙素基因相关蛋白(CGRP)、血管活性肠肽、脑啡肽等均可调节传入神经通路。尽管如此,膀胱局部神经末梢病理性疼痛目前研究并不十分清楚,参与膀胱疼痛的化学介质亟待进一步探究。H2S现在被认为是-NO和CO之后-的第三种气体小分子,其在生理和病理条件下均发挥重要作用。在哺乳动物组织中,H2S以L-半胱氨酸为底物,在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的催化下内源性生成。H2S生成酶在人和哺乳动物膀胱中均广泛表达,并且具有保守性。H2S具有多种生理作用,例如保护细胞、抑制肿瘤发展、调节炎性过程、参与内脏疼痛调节、改变平滑肌运动功能等。H2S可促进膀胱逼尿肌的舒张,改善人及动物模型下尿路症状;H2S在炎症过程中的作用是双向的;H2S可增强环磷酰胺诱导的膀胱疼痛行为,尽管已经证明H2S能够介导膀胱疼痛,但是H2S通过何种机制影响膀胱疼痛以及间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征没有系统的研究。目前有多种小鼠模型模拟IC/BPS的一种或多种症状,我们采用膀胱灌注蛋白酶激活受体4激活肽(PAR4-AP)构建小鼠疼痛模型,因为蛋白酶激活受体4有明显的诱发疼痛效应,而且IC/BPS患者尿液中蛋白酶水平明显增高。本课题欲通过以下两部分内容探讨硫化氢通路在蛋白酶激活受体4相关膀胱疼痛中的作用及可能机制:(1)探究硫化氢信号通路通过巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)介导蛋白酶激活受体4(PAR4)诱发的小鼠膀胱疼痛模型;(2)探究H2S信号通路对蛋白激活受体4诱导的膀胱疼痛模型膀胱炎症以及排尿行为的影响。第一部分硫化氢信号通路介导蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱痛阈改变目的膀胱灌注PAR4-AP诱导膀胱疼痛模型,给予H2S相关药物进行处理,检测小鼠膀胱疼痛行为的改变,以及小鼠膀胱中H2S及相关酶的改变,从而探究硫化氢信号通路在蛋白酶激活受体4(PAR4)中诱导膀胱痛阈改变的作用。方法1.实验分组10-13周龄健康雌性C57BL/6J小鼠分为12组,前10组每组随机分配24只小鼠,最后2组每组随机分配6只小鼠,小鼠用戊巴比妥钠麻醉,插入尿管(PE10,长11mm),按压腹部排出尿液。其中,前10组小鼠每组18只小鼠处理之前手术切除双侧输尿管,以防止肾脏来源的尿液影响实验结果,膀胱灌注1小时后收集尿液并处死,尿液至于-80℃冰箱储存;前10组其余6只小鼠以及后2组小鼠不施行手术,仅给予膀胱灌注,24小时后检测小鼠疼痛行为以及排尿行为。SV-HUC-1细胞置于24孔板、在含有10%胎牛血清的F12K 培养基中孵育,实验前1小时,用新鲜的培养基替换原培养基,分为16组,每组重复3次。2.实验过程由弱到强使用四种不同力度的Von Frey纤维丝0.008g、0.020g、0.040g、0.070g分别刺激小鼠下腹部,记录给予小鼠药物24小时前后不同力度下的膀胱疼痛反应;利用蛋白质印迹(Westernblot)检测膀胱组织中H2S生成酶CBS和CSE的表达情况;利用免疫组织化学染色(IHC)检测膀胱组织中CBS和CSE表达的部位;利用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)检测cbs和cse的表达情况;利用H2S释放实验检测人、小鼠模型、细胞模型中H2S生成酶活性;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同处理组细胞及膀胱组织、膀胱灌注液中MIF表达情况。3.数据处理所有的数据利用SPSS进行分析,数据采用平均数±标准误表示,用t检验或者one-way ANOVA,每组至少六只小鼠,细胞实验重复三次,以P0.05为有显著统计学差异。结果1.硫化氢信号系统存在于小鼠膀胱粘膜和人膀胱SV-HUC-1细胞荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示小鼠膀胱和人膀胱SV-HUC-1细胞中有CBS和CSE表达;免疫组织化学染色检测证明CBS和CSE广泛表达于小鼠膀胱粘膜层细胞的细胞膜和细胞核中。为了检测小鼠膀胱组织和人膀胱SV-HUC-1细胞中是否能够产生H2S,我们留取模型小鼠膀胱灌注1小时后的膀胱灌注液以及人膀胱SV-HUC-1细胞匀浆物行硫化氢释放实验,结果显示小鼠膀胱灌注液可检测到H2S,并且CBS抑制剂AOAA和CSE抑制剂PAG处理组小鼠膀胱灌注液H2S水平减少,NaHS处理组小鼠膀胱灌注液H2S水平增高;细胞实验与之相对应。2.蛋白酶激活受体4(PAR4)激活后硫化氢信号系统上调荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测PAR4-AP或者对照肽处理后人膀胱SV-HUC-1细胞和模型小鼠膀胱CBS和CSE的表达量,然而,CBS和CSE蛋白表达量并没有明显差异;H2S释放实验检测显示PAR4-AP处理后的人膀胱SV-HUC-1细胞、模型小鼠膀胱以及人正常膀胱组织H2S生成量均明显增加。3.硫化氢介导蛋白酶激活受体4诱导的膀胱疼痛超敏感对不同组别小鼠处理之后,利用VonFrey纤维丝刺激小鼠腹部和盆部区域并且记录阳性反应的次数。使用AOAA预处理之后能够完全抑制PAR4诱导的痛觉超敏感;使用NaHS预处理之后能够明显增强PAR4诱导的痛觉超敏感;使用SAM或者PAG预处理之后仅仅部分改变PAR4诱导的小鼠痛觉超敏感。并且,PAG、AOAA、SAM、NaHS在PAR4未激活的情况下不会明显地改变疼痛阈值。我们进一步检测上述处理之后H2S生成量,我们发现PAG或者AOAA预处理之后能够明显减少H2S生成量,并且AOAA的抑制效应明显强于PAG,表明PAG只能部分缓解疼痛。细胞的实验结果显示PAG、AOAA、PAG+AOAA均能明显降低H2S生成量。2017年文献报道新型的CBS抑制剂Benserazide,我们对其在此模型中的作用进行了小鼠行为学检测,Benserazide在PAR4未激活的情况下不会明显地改变疼痛阈值,而在PAR4激活的情况下,只能部分抑制小鼠痛觉超敏感。4.硫化氢可能通过MIF介导蛋白酶激活受体4诱导的膀胱疼痛CSE抑制剂PAG(10mM)和CBS激动剂SAM(1mM)预处理的细胞匀浆物处理组和对照组相比MIF蛋白水平没有明显改变,然而,CBS抑制剂AOAA(1mM或者5mM)预处理的细胞匀浆物MIF蛋白水平升高,H2S供体NaHS(1mM或者5mM)或者CBS激动剂SAM(5mM)预处理的细胞匀浆物MIF蛋白水平明显降低;动物实验上,CBS抑制剂AOAA(50mg/kg)预处理的膀胱组织匀浆物MIF蛋白水平明显升高,但是CSE抑制剂PAG(100mg/kg)预处理的膀胱组织匀浆物实验组和对照组MIF蛋白水平没有明显变化;H2S供体NaHS(50nM)预处理的膀胱组织匀浆物MIF蛋白水平明显降低,但是CBS激动剂SAM(100mg/kg)预处理的膀胱组织匀浆物实验组和对照组MIF蛋白水平没有明显变化;膀胱灌注液的结果与之相对应。结论1.CBS和CSE在SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中表达并能发挥作用,内源性产生H2S;我们首次证明CBS存在于小鼠膀胱。2.蛋白酶激活受体4激活后能够增强SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中硫化氢合成酶活性,从而促进SV-HUC-1细胞以及小鼠膀胱组织中H2S生成,系我们首次发现。3.膀胱内灌注PAR4-AP能够引起膀胱痛觉超敏感,而且这种疼痛能够被H2S增强。4.H2S可能通过MIF介导PAR4小鼠膀胱疼痛模型。第二部分硫化氢信号通路对蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱疼痛模型炎症以及排尿功能的影响目的构建PAR4-AP诱导膀胱疼痛模型,给予H2S相关药物进行处理,检测小鼠膀胱炎症指标改变情况,以及小鼠排尿行为,从而探讨硫化氢信号通路对蛋白酶激活受体4(PAR4)诱导的膀胱疼痛模型炎症以及排尿功能的影响。方法1.实验分组构建蛋白酶激活受体4诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型同第一部分构建环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型,10-13周龄健康雌性C57BL/6J小鼠分为4组,每组随机分配4只小鼠。(1)环磷酰胺(i.p.200mg/kg)4小时后处死;(2)生理盐水(i.p.)4小时后处死;(3)环磷酰胺(i.p.75mg/kg)分别于第1天、第4天、第7天注射,第8天处死;(4)生理盐水(i.p.)分别于第1天、第4天、第7天注射,第8天处死。2.实验过程称重小鼠膀胱以及小鼠体重,根据比值判断膀胱水肿程度;利用HE染色方法从组织学角度检测小鼠膀胱水肿、中性粒细胞浸润等炎症程度;利用无创小鼠排尿行为检测尿斑实验法(VSA)检测小鼠排尿量及排尿频率的情况;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNFα、IL4表达量改变。3.数据处理所有的数据利用SPSS进行分析,数据采用平均数±标准误表示,用t检验或者one-way ANOVA,每组至少六只小鼠,以P0.05为有显著统计学差异。结果1.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起膀胱水肿我们称重小鼠膀胱以及小鼠体重,取其比值进行统计,发现实验组和对照组相比,比值没有显著统计学差异;而环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征模型能引起明显的膀胱水肿,小鼠膀胱与体重比值,实验组和对照组相比有明显统计学差异;H2S本身不会引起膀胱水肿,并且也不会引起PAR4诱导的膀胱疼痛模型膀胱水肿。2.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起膀胱组织学炎性改变PAR4诱导的膀胱疼痛模型不引起明显的膀胱炎性改变,而环磷酰胺诱导的小鼠间质性膀胱炎模型能引起明显的膀胱炎症,表现为中性粒细胞浸润,粘膜水肿;H2S本身不会引起膀胱水肿,并且也不会引起PAR4诱导的膀胱疼痛模型膀胱炎症。3.硫化氢介导蛋白酶激活受体4膀胱疼痛模型不引起排尿行为学改变PAR4激活,经过H2S相关药物的处理,小鼠尿斑数目、尿斑总面积、主尿斑数目、主尿斑总面积以及主尿斑总面积/尿斑总面积均没有统计学差异。4.硫化氢在蛋白酶激活受体4相关炎性因子中的作用荧光实时定量检测蛋白酶激活受体4激活后Th1型转录因子T-bet没有变化,但是Th2型转录因子GATA-3明显增高;ELISA检测试剂盒检测TNFα没有明显改变,而IL4表达明显增加;但是H2S处理之后IL4表达均降低。结论1.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛不伴有明显膀胱炎性改变,H2S在其中亦不发挥抗炎或者促炎效应。2.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛不伴有排尿行为改变,H2S在其中亦不影响排尿行为。3.蛋白酶激活受体4引起的膀胱疼痛影响Th2型细胞以及IL4的表达。4.纵观全局,蛋白酶激活受体4诱导的膀胱疼痛模型是一种新型的间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征小鼠模型,能够引起膀胱痛觉超敏感,但是不伴有明显的膀胱炎性改变以及排尿行为变化。H2S合成酶活性异常以及H2S含量的异常可能与蛋白酶激活受体4激活后膀胱疼痛行为改变密切相关。H2S/CBS/CSE信号通路在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征中可能发挥重要作用,我们的研究为诊断和治疗间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征提供了新的思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R694
【图文】：

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本文编号：2724477