硝酸镧对小鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响

发布时间：2020-07-01 13:57

【摘要】：目的:鉴于稀土镧(La)化合物在生物医学领域具有广泛的应用前景,以及La具有亲骨特性,本课题以小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)为模型,通过分析硝酸镧(La(NO_3)_3)在细胞培养环境中形成的沉淀物种类差异,研究其对BMSCs成骨分化的影响,旨在为高磷血症患者服用碳酸镧对骨代谢的安全性提供依据。方法:1.将不同浓度的La(NO_3)_3溶液分别加入无血清细胞培养液及含血清的细胞培养液中,离心分离沉淀物和上清,通过DLS、SEM、TEM、EDS、蛋白定量等表征方法,对形成的不同沉淀物进行形态及成分分析,确定其物种。2.从小鼠体内分离培养原代BMSCs,首先通过MTT法,研究La(NO_3)_3溶液在两种培养介质中形成的不同沉淀与上清对细胞活性的影响。其次通过ALP活性测定、矿化结节形成等方法研究了不同浓度、不同体系中形成的含La沉淀物对BMSCs增殖、成骨分化及矿化的影响。最后对分子机制做了初步探讨。结果:1.La(NO_3)_3溶液在无血清细胞培养液中,会形成LaPO_4沉淀,主要以纳米聚合物的形式存在,而且随着La~(3+)浓度的增大,LaPO_4聚合物的粒径逐渐增大;在含血清的细胞培养液中,主要会形成La-PO_4-蛋白复合物,同时该复合物的粒径与La~(3+)浓度无关。2.La(NO_3)_3溶液在无血清细胞培养液中,与细胞作用1 d、3 d后,1、10和100μmol/LLa(NO_3)_3对BMSCs活性有抑制作用,0.001、0.01和0.1μmol/L浓度的La(NO_3)_3对BMSCs的活性则无明显影响;而过滤沉淀后的上清液,各浓度La(NO_3)_3对BMSCs的活性均无明显影响。各浓度La(NO_3)_3溶液在含有血清的细胞培养液中与细胞共培养,以及过滤沉淀后形成的上清液与细胞共培养,两种培养介质对BMSCs的活性没有显著差异。10μmol/L及100μmol/L对BMSCs活性有抑制作用,其他浓度对BMSCs均没有显著影响。3.La(NO_3)_3溶液在含有血清的细胞培养液中形成的La-PO_4-蛋白复合物,在完全培养基中,0.001-0.1μmol/L时对BMSCs细胞的成骨分化没有明显影响,1μmol/L的La(NO_3)_3则抑制成骨分化(P0.05),所有浓度对矿化均无明显影响。La(NO_3)_3溶液在无血清细胞培养液中形成的LaPO_4沉淀,加回到完全培养基中,0.001-0.1μmol/L时对BMSCs细胞的成骨分化及矿化无影响,1μmol/L时抑制BMSCs细胞的成骨分化(P0.05),所有浓度对矿化均无明显影响。4.1μmol/L的La(NO_3)_3抑制了成骨基因BMP-2及OCN的表达,抑制了FN蛋白及OCN的蛋白表达,所有浓度的La(NO_3)_3均促进了OPG基因的表达。结论:1.La(NO_3)_3溶液在不同的细胞培养介质中会形成不同的含La沉淀物:在无血清细胞培养液中,主要会形成LaPO_4的纳米聚合体;在含有血清的细胞培养液中,主要会形成La-PO_4-蛋白复合物。2.La(NO_3)_3对BMSCs细胞的作用是含La沉淀物的作用,而不是La~(3+)的作用。3.La(NO_3)_3溶液在不同细胞培养介质中形成的沉淀物对BMSCs的活性、成骨分化和矿化会产生不同的影响:高浓度的La(NO_3)_3在细胞培养介质中形成的含La沉淀物抑制BMSCs细胞的活性,以La(NO_3)_3在无血清培养基中形成LaPO_4沉淀后再加入完全培养基与细胞共培养的抑制作用更明显;高浓度的La(NO_3)_3在细胞培养介质中形成的含La沉淀物抑制成骨分化,以La(NO_3)_3加入含血清培养基形成的La-PO_4-蛋白复合物的抑制作用更明显;各浓度La(NO_3)_3在两种不同细胞培养介质中形成的沉淀物对最终的矿化没有影响。4.高浓度La(NO_3)_3溶液在细胞培养介质中形成的含La沉淀物通过抑制成骨基因BMP-2、OCN以及成骨相关蛋白FN、OCN的表达抑制细胞的成骨分化;各浓度La(NO_3)_3溶液在细胞培养介质中形成的含La沉淀物均促进OPG的基因表达,可能与最终的矿化成骨有关。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

示意图,骨代谢,示意图

图 1-1 骨代谢示意图[23]骨性，由于 La3+与 Ca2+具有相似的离子半径和配位特性的发生。研究发现，稀土 La 化合物在体外骨的重塑过程研究了体外 LaCl3对 MC3T3-E1（小鼠成骨细胞系）增殖，结果表明 LaCl3在低浓度（10-10-10-8mol/L）时促进 M时对细胞增殖没有影响，高浓度（10-5-10-3mol/L）则抑制化方面，低浓度的 LaCl3（10-10-10-6mol/L）促进了碱性磷10-4、10-3mol/L）则抑制 ALP 活性；对矿化结节形成的影0-7mol/L）促进矿化结节形成，高浓度（10-4、10-3mol/L）ol/L 时则对矿化结节形成没有影响。Yu 等[26]探讨了 LaC中矿物结晶形成的影响，结果证实，La 易沉积在基质矿l3对矿化结节数目形成无影响，但通过高分辨透射电子显析仪观察到 LaCl3的沉积降低了二水磷酸氢钙（DCPD）

形貌,细胞活力,沉淀物

图 2-6 La3+及含 La 沉淀物对 BMSCs 细胞活力的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs. control，n=3）A）（B）含不同浓度La(NO3)3的无FBS的DMEM与过0.22 μm滤膜后的滤液在1 d、3 d对BMSCs细胞活力的影响（C）（D）含不同浓度La(NO3)3的含10%FBS的DMEM与过0.22 μm滤膜后的滤液在1 d、3 d对BMSCs细胞活力的影响.4 本章小结本章首先通过 DLS、SEM、TEM、EDS 等表征手段，观察了 La(NO3)3分别在无血和有血清两种培养基中形成的沉淀物的粒径大小、形貌以及元素组成，以明确在有无清存在的情况下，La(NO3)3在培养基中形成的沉淀物是否不同。此外观察了不同培养质中含 La 沉淀物在 BMSCs 细胞表面的形貌及元素组成，最后，通过 MTT 的方法，察了 La(NO3)3对细胞的作用是 La3+的作用还是含 La 沉淀物的作用。

【参考文献】