高草酸血症在尿毒症血管钙化中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-02 15:28

【摘要】：研究背景心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)尤其是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)患者死亡的最常见原因。血管钙化(vascular calcification,VC)是预测心血管和全因死亡率的一个强有力的因素。传统上认为,钙-磷稳态失衡是ESRD患者血管钙盐沉积的主要原因,高钙和高磷血症可以促进血管平滑肌细胞转化为成骨样细胞从而在血管钙化中发挥重要作用。然而,即使有效控制钙磷水平,慢性肾衰竭患者VC的发生和进展仍然高于普通人群,这表明ESRD中存在一些其他因素可能参与血管钙化的发生。草酸是ESRD患者潴留的尿毒症毒素之一,目前体内、体外实验均有研究证明高草酸血症与心血管功能密切相关。冠脉粥样硬化患者的尸检病例中发现其硬化血管斑块中存在草酸盐沉积。氧化应激在血管钙化的病理生理过程中发挥了重要的作用,高草酸可以引起肾小管上皮细胞氧化应激增强引发细胞的继发性损伤,我们推测随着肾功能衰竭引起的高草酸血症可能也与CKD的氧化应激状态相关从而影响血管钙化的进展。研究目的本研究的主要目的是探究高草酸血症在尿毒症血管钙化中的作用及其激活氧化应激反应参与血管钙化的相关性,以及探究产甲酸草酸杆菌的降草酸治疗是否可以改善尿毒症的氧化应激状态和血管钙化的进展。研究方法收集20例CKD3-5期患者,按照性别、年龄匹配20例肾功能正常的患者作为对照组。收集血清监测血草酸浓度及晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein product,AOPP),并探究其相关性。收集ESRD患者动脉组织,采用离子色谱法检测血管草酸盐和磷酸盐含量。体外实验探究不同浓度的草酸对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的作用及机制。内皮细胞和平滑肌细胞在不同浓度的草酸刺激后收集细胞的上清用ELISA检测血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、TNF-а、IL-6、CRP、AOPP的表达,观察草酸是否会促进细胞的氧化应激及炎症因子的分泌。通过Realtime-PCR和Western-blot检测runt相关的转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等成骨转录因子的表达,观察平滑肌细胞在高草酸的刺激下是否可以向成骨样细胞转化及具体的机制。体内实验采用apoE~(-/-)的小鼠行左肾摘除+右肾电凝术,建立加速性动脉钙化的尿毒症模型。具体分组:对照组、尿毒症模型组。每四周收集小鼠24小时尿液,采用离子色谱法检测尿草酸盐排泄量。于造模12周处死动物,收集各组血液标本。采用自动生化分析仪检测血尿素、血草酸、血钙、血磷、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯,离子色谱法检测血草酸浓度,ELISA法检测MDA、SOD、AOPP、TNF-а、IL-6等。分离主动脉,采用Von Kossa染色评价血管钙化情况,通过半定量的方法比较两组钙化斑块的面积大小;同时采用离子色谱法对血管的草酸盐与磷酸盐的含量进行定量检测。随后采用产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OxF)治疗降低造模组小鼠血草酸水平,于干预12周后处死动物,观察OxF干预后血尿草酸、血清氧化应激指标、血管钙化及血管草酸盐含量的变化。研究结果临床研究结果发现CKD3期患者血草酸浓度为对照组的3倍左右,CKD4-5期患者血草酸浓度为对照组的5倍左右,血草酸浓度与肌酐、AOPP浓度呈正相关,ESRD患者肾动脉中检测到草酸盐含量4.89±2.12ug/g,血草酸浓度与血管草酸盐含量存在呈正相关,r=0.78,但P0.05,可能为血管数量太少所致。血管内皮细胞在高草酸(200μM和500μM)刺激24小时后,用Elisa检测细胞上清的MDA、TNF-а、IL-6、CRP、AOPP显著升高,SOD活力显著降低,这一结果与Real-time PCR的结果相一致,但平滑肌细胞氧化应激指标没有明显的改变,western-blot结果显示高浓度的草酸可激活Jak2/Stat3信号通路,这表明高草酸可以激活Jak2/Stat3信号通路促进内皮细胞的氧化应激和炎症因子的分泌,平滑肌细胞在高草酸刺激下,RUNX2、ALP等成骨转录因子表达显著升高,伴有Erk 1/2信号通路的激活。体内实验发现尿毒症组血尿素、草酸、血磷、低密度脂蛋白、总胆固醇及血清的氧化应激指标AOPP、MDA显著高于对照组,SOD活力显著低于对照组。此外,尿毒症组钙化斑块显著高于对照组,且血清钙、磷、钙磷乘积及血草酸浓度均与钙化斑块面积成正相关,相关系数r分别为0.67,0.56,0.50,0.53,P均小于0.05。离子色谱法检测发现对照组和尿毒症组小鼠的钙化血管中均检测到草酸盐,但尿毒症组草酸盐的含量显著高于对照组(尿毒症组草酸盐含量为24.96±7.59ug/g,草酸盐与磷酸盐的比值为1:282,对照组草酸盐含量为2.64±0.54ug/g,草酸盐与磷酸盐的比值为1:415),提示相比单纯的血管钙化,慢性肾衰竭中草酸对血管钙化的贡献明显增加。此外,血清草酸水平与血管的磷酸盐及草酸盐的定量成正相关,相关系数r分别为0.77,0.59,P均小于0.05,血草酸浓度与MDA、AOPP、IL-6成正相关,相关系数r分别为0.70,0.52,0.53,与SOD活力成负相关,r=-0.53,P0.05。产甲酸草酸杆菌干预12周后,小鼠粪便中产甲酸草酸杆菌的浓度维持在10~6cfu/g,OxF干预后血草酸、MDA、AOPP、TNF-а均显著下降,SOD显著升高。Von Kossa染色半定量分析结果显示CKD+OxF干预组的血管钙化面积较CKD组减少但差异没有统计学意义,CKD+OxF干预组血管草酸盐含量较CKD组显著降低,P0.05。结论本研究结果显示,CKD患者血草酸浓度与血肌酐、氧化应激产物浓度成正相关,ESRD患者的血管壁除了磷酸盐还有少部分草酸盐的沉积,为了进一步证实血草酸浓度与血管草酸盐含量的相关性需进一步扩大血管的样本数量。体外实验中显示高草酸可促进血管内皮细胞的氧化应激和炎症因子的分泌,进一步证实了高草酸与氧化应激的相关性,且高草酸可以促进平滑肌细胞成骨样转录因子表达升高从而促进血管钙化进展。动物实验中,CKD和对照组钙化血管中均检测到草酸盐,CKD组血草酸浓度和血管草酸盐含量明显高于对照组,血草酸浓度与氧化应激指标、血管草酸盐与磷酸盐的定量成正相关,产甲酸草酸杆菌的干预降低了血草酸浓度和血管壁草酸盐的含量,并且改善了CKD的氧化应激状态。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692.5
【图文】：

草酸,血肌酐,浓度,对照组

L） 78.85±8.33 167.20±29.42**692.90±106.47**<0.0001 1.26±0.23 1.47±0.37 1.98±0.41*0.0004 2.36±0.45 2.42±0.38 2.46±0.22 0.50 钙2.91±0.65 3.34±0.42 4.88±1.10**0.0003 143.10±23.10 343.40±64.71**549.50±118.70**<0.0001 114.70±4.83 109.30±6.34*92.90±9.47**<0.0001 L） 2.88±0.99 10.69±4.76**18.54±5.98**<0.0001 组相比，*p<0.05，**P<0.001KD3 期血草酸浓度约是对照组的 3 倍，P=0.0001， t=6.78；CKD4-5 期是对照组的 5 倍，P<0.0001，t=11.02，且血草酸浓度与血肌酐浓度成正相P<0.0001，见图 1-3。

草酸盐,磷酸盐,离子色谱法,动脉

军军医大学硕士学位论文（三）慢性肾衰竭高草酸血症与血管钙化的相关性ESRD 患者血管中可以检测到草酸盐（图 1-4 中离子色谱法可看到草酸盐特定），且草酸盐含量为 4.89±2.12 ug/g，磷酸盐含量为 1656.12±387.70 ug/g，血清草量与动脉草酸盐含量成正相关，r=0.78, 但 P=0.12>0.05，见图 1-4。

【相似文献】