敲低PLCε通过抑制AR活性增加去势抵抗性前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的敏感性

发布时间：2020-07-02 15:59

【摘要】：目的:PLCε(Phospholipase Cε)是一种癌基因,在激素敏感性前列腺癌中高表达,Hedgehog/Gli信号通路在前列腺癌(Prostate cancer,PCa)组织中存在过度激活的现象,前期研究结果提示,在PCa中PLCε以及Hedgehog信号通路均参与雄激素受体(Androgen receptor,AR)的调节,但PLCε、Hedgehog/Gli在去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)中的作用尚不清楚。本研究的目的是探讨PLCε、Hedgehog/Gli与AR在CRPC中的相互作用关系以及作用机制,以及在CRPC细胞中敲低PLCε是否通过调节AR活性来影响其对恩杂鲁胺的药物敏感性。方法:1)收集2010年1月至2015年8月重庆医科大学附属第一医院的良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组织标本30例,前列腺癌(PCa)组织标本64例,以及CRPC石蜡切片和组织标本(共27例)。使用免疫组织化学方法(IHC)检测PLCε和Gli-1、Gli-2的蛋白表达水平,统计分析PLCε、Gli-1和Gli-2在BPH、PCa以及CRPC组织中的表达差异及相关性,并分析PLCε在CRPC组织中的表达情况与临床及病理参数之间的关系,进一步分析CRPC患者生存率(overall survival,OS)和无进展生存期(progression-free survival,PFS)。2)使用LNCaP、22RV1、EN-R三个细胞株,(22RV1、EN-R代表CRPC细胞)Western blot及RT-qPCR方法检测三株细胞中PLCε蛋白及mRNA水平的表达。使用慢病毒载体LV-shPLCε转染LNCaP、22RV1、EN-R细胞以敲低PLCε,用克隆形成实验以及CCK-8实验检测细胞的增殖能力;Transwell实验观察细胞的侵袭能力。并根据CCK-8实验计算各株细胞在不同处理组中恩杂鲁胺的IC50值,从而评估各株细胞对恩杂鲁胺的敏感性。3)使用22RV1、EN-R两个细胞株,慢病毒载体LV-shPLCε敲低PLCε,以及单独或联合使用Hedgehog/Gli信号通路抑制剂GANT61处理,Western blot及RT-qPCR方法检测两株细胞中PLCε、Hedgehog信号通路相关分子、AR等蛋白及mRNA水平的表达。4)敲低PLCε或/和过表达Gli-1/Gli-2处理EN-R细胞。细胞免疫荧光实验检测AR蛋白的核、浆表达情况差异;Western blot及RT-qPCR分别检测EN-R细胞株中PLCε、Gli-1、Gli-2、AR、PSA、STAT3以及磷酸酸化STAT3的蛋白及mRNA表达水平,并统计分析其表达差异。5)4周龄的裸鼠分别于皮下接种2x10~6个EN-R(cont组)细胞或LV-shPLCεEN-R(LV-shPLCε组)细胞,然后每组小鼠再分成两组,分别予以10mg/kg PBS或恩杂鲁胺喂养,32天后处死小鼠,计算瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线。结果:1)与良性前列腺增生组织相比,PLCε、Gli-1及Gli-2在大多数PCa以及CRPC组织中的表达明显增加,而且PLCε(P=0.0447)、Gli-1(p=0.0152)在CRPC组织中的表达与其在PCa组织中的表达差异具有统计学意义,而Gli-2在PCa及CRPC组织中的表达中无显著性差异(p=0.0585)。在CRPC组织中,PLCε的表达与Gli-1(r=0.586,p=0.01)及Gli-2(r=0.409,p=0.034)的表达均呈正相关。Kaplan-Meier生存分析显示,在CRPC组织中,PLCε表达阳性的患者(PFS=24个月)与PLCε表达阴性的患者(PFS=28个月)之间的中位无进展生存期具有统计学差异(P=0.025)。在PCa组织中,PLCε表达阳性的患者(OS=61个月)与PLCε表达阴性的患者(OS=68个月)之间的总体生存期也具有显著的统计学差异(P=0.027)。2)PLCε在LNCaP、22RV1、EN-R细胞中均高表达,与LNCaP细胞相比较,它在22RV1及EN-R细胞中的表达具有统计学差异。Gli-1及Gli-2在LNCaP细胞中低表达,但在22RV1及EN-R细胞中均高表达。CCK-8实验结果显示,LV-shPLCε或/和GANT61处理均显著地抑制22RV1、EN-R细胞的活性。克隆形成实验显示LV-shPLCε或/和GANT61能够抑制CRPC细胞的增殖能力。Transwell实验结果显示,LV-shPLCε或/和GANT61抑制CRPC细胞的侵袭能力。CCK-8实验结果显示,LV-shPLCε或/和GANT61增加了CRPC细胞对恩杂鲁胺的敏感性。3)在22RV1及EN-R细胞中敲低PLCε抑制了Gli-1/Gli-2以及AR的mRNA和蛋白表达水平,反之抑制Gli-1/Gli-2的表达并不影响PLCε的表达,提示PLCε是Gli-1/Gli-2的上游调节因子。然而,在PLCε敲低后,Smo(经典Hh信号通路中Gli的上游调控基因)没有表现出显著的mRNA和蛋白表达变化。提示PLCε通过非经典的Hh/Gli信号途径影响Gli-1/Gli-2的表达。4)敲低PLCε或/和过表达Gli-1/Gli-2处理EN-R细胞,细胞免疫荧光实验结果提示敲低PLCε通过Gli-2/AR信号途径来抑制AR的核转位,Western blot及RT-qPCR结果显示敲低PLCε通过p-STAT3信号途径来影响AR的靶基因PSA的表达。5)动物实验结果显示敲低PLCε抑制了去势抵抗性前列腺癌细胞皮下移植瘤的生长并增加了CRPC细胞移植瘤对恩杂鲁胺的药物敏感性。结论:1.PLCε阳性表达预示CRPC患者较差的临床预后。2.抑制PLCε的表达可以抑制CRPC细胞的增殖以及侵袭能力。3.PLCε通过非经典的Hh/Gli信号途径以及p-STAT3信号途径调节AR的活性,从而增加了去势抵抗性前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的药物敏感性。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25
【图文】：

免疫组化染色,学位论文,医科大学,博士研究生

BPH、PCa与CRPC组织中PLCε、Gli-1和Gli-2的免疫组化染色Figure1.1ImmunohistochemicalstainingofPLCε、Gli-1andGli-2inBPH,PCaandCRPCtissues