脂联素对DOCA-盐联合血管紧张素Ⅱ诱导肾损伤的保护作用及其机制

发布时间：2020-07-03 17:59

【摘要】：目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)流行率在全世界范围内逐渐增加,已成为最主要的公共卫生负担。目前对于CKD的治疗手段仍然很有限,迫切需要开发新的治疗策略来延缓CKD的进展。肾脏纤维化是多种CKD发展演变为肾衰竭的必经阶段,以足细胞数目减少和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要特征。在众多致病因素中,肾素血管紧张素醛固酮系统的主要活性肽—血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)作为有效刺激因子,在足细胞损伤、系膜细胞及间质成纤维细胞激活、炎症细胞募集、ECM蛋白合成增多及蛋白尿增加等方面起重要作用,是导致肾脏纤维化发生的关键因素。脂联素(adiponectin,Ap N)作为一种脂肪细胞分泌的脂肪因子,由于其改善胰岛素抵抗,抗炎及血管保护特性而备受关注。流行病学资料表明Ap N在肥胖及糖尿病中下调。但是,在CKD中Ap N升高而非降低,目前其机制尚不清楚。已有研究证实,在部分肾切除慢性进展性肾脏病的动物模型中,Ap N基因敲除的小鼠表现为蛋白尿,肾小球肥大,氧化应激,足突融合和肾小管间质纤维化加重,可通过Ap N治疗有所改善。另一项研究表明,利用病毒介导基因转染过表达Ap N可缓解链脲霉素诱导糖尿病大鼠蛋白尿。我们研究组的晚近一项研究结果显示利用重组Ap N治疗可减少db/db小鼠的蛋白尿及肾小球硬化指标,Ap N抗纤维化作用不依赖于其降糖及改善胰岛素敏感作用,可能是通过其抗炎和拮抗血管紧张素而发挥作用,Ap N可减轻Ang II和TGFβ刺激肾小球系膜细胞导致的纤维化指标。但是,在体内实验中,Ap N对Ang II诱导肾损伤的作用及机制方面的研究目前未见报道。基于这些发现,我们假设在基因修饰动物水平上,Ap N可缓解脱氧醋酸皮质酮(deoxycorticosterone acetate,DOCA)-盐联合Ang II诱导肾脏损伤,是一种潜在的治疗CKD的新选择。为了证明这一假设,我们构建可诱导型人源性全长Ap N转基因小鼠,利用DOCA-盐联合Ang II诱导肾损伤模型,观察Ap N是否能够缓解DOCA-盐联合Ang II诱导的肾损伤及其机制。研究方法:1、通过DNA体外重组技术获得目的基因,将目的基因切除,纯化并通过显微注射引入C57BL/6J小鼠单细胞胚胎中。通过PCR技术鉴定两个阳性雌性首建鼠。用转基因表达的首建鼠与野生型C57BL/6J小鼠进行育种。随后的阳性转基因F1小鼠用于与野生型小鼠连续繁殖以建立稳定的转基因品系。2、分别选取健康雄性小鼠8-10周龄,分三组:野生型C57BL/6J小鼠组(WT)(n=5),野生型C57BL/6J小鼠接受DOCA-盐联合Ang II处理组(WT/DOCA+Ang II)(n=5),Ap N转基因型小鼠接受DOCA-盐联合Ang II处理组(Ap N-Tg/DOCA+Ang II)(n=5),三组小鼠实验开始前1周均接受单肾切除,第0天,WT/DOCA+Ang II组和Ap N-Tg/DOCA+Ang II组小鼠皮下置入Ang II微量泵,速度为1.0ng/min/g和25mg DOCA药片,及1%氯化钠饮水共3周。同时予0.15%吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol,I3C)的食物饮食,每周行24小时代谢笼试验,共3周,监测体重,血压,饮水量,尿量,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量。3、Western blot检测Ap N在不同剂量I3C诱导的人源性全长Ap N转基因小鼠血清,肝脏,脂肪组织中的表达。检测不同组小鼠肾皮质纤维化指标PAI-1,FN,α-SMA,炎症指标NF-κB-p65,p ERK1/2,氧化应激指标NOX2,p47phox和足细胞损伤指标B7-1的变化。4、Real-time RT-PCR法检测不同组小鼠肾皮质中TGF-β1,FN,COL I,COL IV,megalin,cubilin,KIM-1和NGAL的表达。5、免疫荧光法检测不同组小鼠肾脏皮质Ap N,FN,podocin,nephrin,WT-1,Ki-67,F4/80的沉积。6、过碘酸雪夫染色(periodic acid-shiff’s reaction,PAS)检测不同组小鼠肾小球系膜区ECM增生改变。7、Masson’s Trichrome染色检测不同组小鼠肾小管间质纤维化。8、电镜观察不同组小鼠足细胞改变。结果:1、成功构建可诱导型人源性全长Ap N肝脏组织特异性表达载体p BSskplus-cyp1a1-human Ap N;建立稳定的可诱导型人源性全长Ap N转基因鼠系。2、WT,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II三组小鼠体重无显著性差异;与WT组比较,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组血压,24小时饮水量,尿量,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量均显著性升高;与WT/DOCA+Ang II比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组血压,饮水量,尿量无显著性变化;与WT/DOCA+Ang II比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量均显著性下降。3、Western blot结果显示,3.1、与WT+0.3%I3C组比较,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C两组Ap N在肝脏组织中表达显著性增强,与Ap N-Tg+0.15%I3C组比较,Ap N-Tg+0.3%I3C组Ap N在肝脏组织中表达无显著性差异;3.2、与WT+0.3%I3C组比较,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C两组Ap N在血清中表达显著性增强,与Ap N-Tg+0.15%I3C组比较,Ap N-Tg+0.3%I3C组Ap N在血清中表达显著性增强;3.3、WT+0.3%I3C组,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C三组Ap N在脂肪组织中表达无显著性差异;3.4、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组Ap N在血清中表达无显著性变化,与WT组和WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组Ap N在血清组织中表达显著性增强;3.5、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组肾脏皮质组织中PAI-1,FN,α-SMA,B7-1,p NF-κB-p65,NOX2,p47phox,p ERK1/2蛋白表达显著性增强,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾脏皮质组织中PAI-1,FN,α-SMA,B7-1,p-NF-κB-p65,NOX2,p47phox,p ERK1/2蛋白表达显著性降低,与WT组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾脏皮质组织中PAI-1,B7-1,p NF-κB-p65显著性降低,FN,α-SMA,NOX2,p ERK1/2显著性升高,p47phox蛋白表达无显著性变化;3.6、与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组小鼠尿白蛋白显著性降低;4、Real-time RT-PCR法检测结果显示,4.1、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II和Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组肾脏皮质组织中TGF-β1,FN,Col I,Col IV,KIM-1,NGAL m RNA的表达显著性增强,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾脏皮质组织中TGF-β1,FN,Col I,Col IV,KIM-1,NGAL m RNA的表达显著性降低;4.2、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组肾脏皮质组织中cubilin和megalin m RNA的表达显著性降低,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾脏皮质组织中cubilin和megalin m RNA的表达显著性升高;5、组织免疫荧光结果显示,5.1、与WT/DOCA+Ang II组相比,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组中肾小球组织中可见Ap N沉积;5.2、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组肾小球结构中FN表达显著性增强,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球结构中FN表达显著性降低,与WT组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球结构中FN表达无显著性变化;5.3、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组肾小球结构中nephrin,podocin,WT-1表达显著性降低,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球结构中nephrin,podocin,WT-1表达显著性增加,与WT组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球结构中nephrin,podocin,WT-1表达无显著性变化;5.4、与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾组织中Ki67,F4/80表达显著性增强,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾组织结构中Ki67,F4/80表达显著性降低;6、PAS结果显示,与WT组比较,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组肾小球系膜基质评分显著性增加,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球系膜基质评分显著性降低。7、Masson’s Trichrome染色显示,与WT组比较,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组肾小管间质损伤评分显著性增加,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小管间质损伤评分显著性降低。8、电镜结果显示,与WT组比较,WT/DOCA+Ang II组肾小球足细胞融合,脱落,与WT/DOCA+Ang II组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II组肾小球足细胞融合,脱落明显缓解。与WT组比较,Ap N-Tg/DOCA+Ang II两组肾小球足细胞无显著性改变。结论:1、建立可诱导型人源性全长Ap N转基因小鼠动物模型。在转基因小鼠中,Ap N在肝脏表达,分泌入血,到达肾脏发挥作用,不影响脂肪组织表达。2、成功建立DOCA-盐联合Ang II诱导小鼠肾脏损伤模型,Ap N缓解DOCA-盐联合Ang II诱导的尿白蛋白,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量,但对血压,体重,尿量及饮水量无影响。3、Ap N改善DOCA-盐联合Ang II诱导小鼠肾脏纤维化,足细胞损伤,氧化应激,及炎症因子指标。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

特异性表达载体

ApN肝脏组织特异性表达载体pBSskplus-cyp1a1-humanApN

质粒,酶切鉴定,融合基因,结构设计

14图 2 BssH II/Not I 酶切鉴定 pBSskplus-cyp1a1-human Aarker，图中 2 代表 pBSskplus-cyp1a1-human ApN 的质粒，pBSskplus-cyp1a1-human ApN 的质粒。图 3 cDNA 融合基因结构设计

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