肝再生增强因子对缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞线粒体动力学的影响及机制研究

发布时间：2020-07-14 04:27

【摘要】：目的:我们前期研究已经证实肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)在缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)肾损伤中具有抑制肾小管上皮细胞凋亡作用,但其具体机制尚未完全阐明。本研究采用ALR-EGFP-3FLAG表达融合蛋白慢病毒载体转染人肾小管上皮细胞(HK-2)的方法,构建稳定过表达ALR的人肾小管上皮细胞株;观察体外缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)处理对HK-2细胞线粒体动力学(mitochondrial dynamics)相关蛋白表达的影响,并探讨过表达ALR对HR诱导HK-2细胞线粒体动力学的影响及作用机制。方法:将特异性过表达人23kD ALR的慢病毒Lv-ALR(ALR-EGFP-3FLAG)转染HK-2细胞,慢病毒Lv-vector转染HK-2细胞作为对照,通过观察EGFP荧光和利用抗Flag抗体通过Western Blot检测HK-2细胞中23kD ALR的蛋白表达情况对HK-2细胞进行筛选处理;采用Hank's平衡盐溶液结合缺氧复氧(HR)的方法对HK-2细胞进行处理,模拟体内IR肾损伤模型;实验分为Normal组、IR组、Lv-vector+IR组、Lv-ALR+IR组。缺氧6h复氧12h刺激后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。STRING v10预测蛋白-蛋白相互作用网络。Western Blot检测线粒体分裂关键蛋白Drp1、p-Drp1、MTFP1及相关信号通路蛋白mTOR、p-mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1的蛋白水平。Western Blot检测线粒体融合关键蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达情况。结果:荧光显微镜观察转染细胞GFP荧光表达丰度,感染效率约80%纳入后续检测。Western Blot检测显示,与Lv-vector组比较,Lv-ALR组细胞23 kD ALR蛋白得到有效表达(P0.05),与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组23 kD ALR蛋白同样有效表达(P0.05);在H/R处理后6、12、24小时线粒体分裂关键蛋白Drp1表达逐渐上调,于H6R12达峰值,且H6R24仍处于较高水平;流式细胞仪检测显示过表达ALR可抑制H/R诱导的HK-2细胞凋亡;与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组中Drp1和MTFP1表达均明显下调(P0.05),并且过表达ALR也使p-Drp1 Ser637激活;与Lv-vector+IR组比较,Lv-ALR+IR组中线粒体分裂相关信号通路蛋白p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1比值明显增高(P0.05);线粒体融合关键蛋白OPA1表达水平上升(P0.05),而Mfn1、Mfn2表达水平无明显变化(P0.05)。结论:过表达23kD ALR可通过抑制线粒体分裂和促进线粒体内膜融合对缺氧复氧处理肾小管上皮细胞线粒体具有保护作用,从而抑制肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾IR损伤;其抑制线粒体分裂的作用途径与活化mTOR/4E-BP1信号通路有关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

达肝再生增强因子的人肾小管上皮细胞株慢病毒相关信息由中国吉凯生物公司构建，为获取目的基因片段，87，带 EGFP 荧光和 3FLAG 标签（图 1），同时将阴性对照。表 1 引物序列Tab1 Primer sequenceseq1)-P1 ATCGGGATCCCGCCACCATGGCGGC1)-P2 CGGGTACCGGTGTCACAGGAGCC

图 2. IR 处理对 HK-2 细胞线粒体分裂的影响,与正常组比较*p < 0.05，**p < 0.01.Figure 2. Effects of IR treatment on mitochondrial fission in HK-2 cells, *p < 0.05 and **p <0.01 versus the normal group.3.2 过表达慢病毒转染成功确定HK-2 细胞转染过表达 ALR 慢病毒 72 小时后，在荧光显微镜下观察转染效率约 80%以上的细胞组初步纳入后续实验；利用抗 Flag 抗体通过 Western blot 检测ALR 蛋白表达情况。我们同时也检测了经 I6R12 处理的转染过表达慢病毒 HK-2细胞的 ALR 蛋白表达。结果显示，转染了慢病毒的 HK-2 细胞中 23kD ALR 都得到了有效表达（图 3）。

图 3. 过表达慢病毒转染成功确定, 与 Lv-vector 组或 Lv-vector+IR 相比** P< 0.01.Figure 3. The determination of successful transfection of the ALR-containing lentiviralparticles, **P<0.01, as compared with the Lv-vector group or the Lv-vector+IR group.3.3 过表达 ALR 对 IR 处理 HK-2 细胞凋亡的影响线粒体分裂与细胞凋亡紧密相关。本研究通过流式细胞仪检测 HK-2 细胞凋亡率。根据别藻蓝素(APC)和增殖染料 eFluor 450 (PB450-A)的染色情况，凋亡细胞群组成如下：活细胞(APC 和 PB450-A )、早期凋亡细胞(APC 和 PB450-A +)、晚期凋亡细胞(APC +和 PB450-A +)和坏死细胞(APC +和 PB450-A -)。将早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞一起纳入为总的凋亡细胞水平。与 Lv-vector+IR 组相比，Lv-ALR+IR 组的细胞凋亡率明显下降(9.74±1.15% vs. 26.88±2.66%, p < 0.01)，提示过表达 ALR 可以抑制 IR 诱导的 HK-2 细胞发生凋亡（图 4）。

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本文编号：2754484