白藜芦醇预处理的间质干细胞对急性肾损伤的保护及机制研究

发布时间：2020-07-16 20:37

【摘要】：目的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种具有高发病率和高病死率的临床综合征,但现有方法疗效不佳。应用间质干细胞修复AKI已有广泛报道,但其治疗效率仍需进一步提高。本文旨在研究小分子药物白藜芦醇(resveratrol,RES)预处理对人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)治疗AKI疗效的增强作用,并探讨其相关机制。方法细胞实时监测和MTT法确定RES预处理huc MSC的浓度和时间。构建顺铂诱导的AKI大鼠模型,经尾静脉分别注射DMSO或RES预处理的huc MSC(DMSO-或RES-huc MSC)。通过血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平,肾组织切片HE染色、肾小管损伤评分、Western blot、免疫组化和TUNEL实验比较RES处理前后huc MSC对AKI治疗效果的差异。体外细胞模型采用大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,经顺铂处理后与DMSO-或RES-huc MSC共培养,流式细胞术、Western blot、免疫组化和TUNEL实验观察NRK-52E细胞的凋亡情况。在机制研究方面,采用Western blot和平板克隆实验检测RES对huc MSC生物学功能的影响。QRT-PCR筛选RES作用后huc MSC中变化最明显的因子(PDGF-DD),Western blot检测PDGF-DD下游ERK通路的活化情况。利用si RNA敲减PDGF-DD以证实其在RES改造huc MSC中的作用。同时,在AKI大鼠模型中进一步研究PDGF-DD在RES-huc MSC发挥肾保护功能中的作用。此外,我们收集DMSO-和RES-huc MSC的培养上清(Cd M),观察不同Cd M对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖和迁移能力的影响。并采用免疫荧光检测大鼠肾组织中CD31的水平。通过si RNA敲减实验探讨PDGF-DD在RES-huc MSC促血管生成中的作用。结果细胞实时监测和MTT法确定RES处理huc MSC的浓度和时间分别为20mmol/L,12h。RES预处理增强huc MSC对顺铂诱导的AKI的修复作用,表现为血清Cr、BUN水平降低,肾小管结构保存完整,肾小管损伤评分低,管型沉积少,肾小管上皮细胞凋亡明显改善。顺铂损伤细胞模型结果进一步佐证上述结论。与huc MSC相比,RES-huc MC能更好地抑制顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡。在机制方面,其一,RES促进huc MSC自分泌PDGF-DD,活化下游ERK通路,抑制huc MSC凋亡,促进huc MSC增殖。反之,敲减PDGF-DD抑制RES-huc MSC的ERK通路,削弱RES对huc MSC的抗凋亡和促增殖作用。其二,RES促进huc MSC旁分泌PDGF-DD,上调RES-huc MSC组大鼠肾组织中PDGF-DD和PDGFR-b的水平,活化了肾小管上皮细胞ERK通路,抑制肾小管上皮细胞凋亡。而敲减PDGF-DD后,RES-huc MSC组肾小管上皮细胞ERK通路受抑制,肾小管上皮细胞凋亡增加,RES-huc MSC对AKI大鼠的修复作用减弱。其三,与DMSO-huc MSC的Cd M相比,RES-huc MSC的Cd M促进HUVEC增殖和迁移,且RES-huc MSC组大鼠肾组织中CD31的表达较DMSO-huc MSC组显著上调。但敲减PDGF-DD后,RES-huc MSC的Cd M对HUVEC的迁移和增殖作用减弱,且大鼠肾组织中CD31的水平降低。结论RES通过促进huc MSC分泌PDGF-DD,活化肾小管上皮细胞ERK通路,促进内皮细胞血管生成,从而提高了huc MSC在AKI中的修复效率,为增强干细胞疗效提供了新策略。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

技术路线,共培养,间质干细胞,机制研究

白藜芦醇预处理的间质干细胞对急性肾损伤的保护及机制研究共培养 36h）、RES-hucMSC（NRK-52E 经顺铂处理 12h 后与 RES-hucMSC 共培养 36h）。流式细胞术、Western blot、免疫组化和 TUNEL 实验检测 NRK-52E 细胞的凋亡情况。见技术路线 1。

技术路线,促血管生成,相关机制,旁分泌

图 2.2 技术路线 2：小分子药物 RES 对 hucMSC 的作用研究2.2.4 RES 改造 hucMSC 的相关机制从干性和旁分泌两个角度考虑，qRT-PCR 筛选出 RES 作用前后 hucMSC 中变化最明显的分子 PDGF-DD。经小干扰 RNA（siRNA）敲减hucMSC 中PDGF-DD后，从 hucMSC 增殖、凋亡和促血管生成方面重新评价 RES 对 hucMSC 的体外作用。见技术路线 3。