人脐带间充质干细胞对环磷酰胺导致的大鼠肝、肾损伤的治疗作用研究

发布时间：2020-07-21 20:02

【摘要】：目的:1.研究人脐带间充质干细胞(UC-MSC)对环磷酰胺(CTX)导致的大鼠肝、肾损伤的治疗作用。2.探索在UC-MSC治疗CTX导致的肾损伤中经典Wnt/b-catenin信号通路所发挥的作用。方法:1.UC-MSC的分离、培养和鉴定从新鲜脐带中分离并培养贴壁细胞至第4代,显微镜下观察其形态,流式细胞术鉴定其细胞表型,并鉴定其成骨、成脂、成软骨等诱导分化能力。2.环磷酰胺导致大鼠肝、肾损伤模型的建立并鉴定将12只SD大鼠随机分为Control组和CTX组,CTX组大鼠腹腔注射CTX(200mg/Kg),对照组以相同的方式注射等量PBS。24小时后处死,检测以下指标确定造模是否成功。2.1检测血清中生化指标改变外周血离心(3500g,20min)取上清,检测血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血尿素氮(BUN)和肌酐(creatinine)的表达。2.2检测肝、肾组织均浆中氧化应激损伤指标:应用超声法将肝、肾组织制成10%的组织均浆,检测其中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、脂质过氧化物(LPO)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-PX)的表达。2.3组织病理学检查肝、肾组织切片,行HE染色,比较其病理学改变。3.UC-MSC对CTX导致的大鼠肝、肾损伤的治疗作用的实验研究将成年雄性SD大鼠随机分成Control组、CTX组和CTX+UC-MSC组,将CTX+U-MSC组第1次尾静脉注射UC-MSC记为实验第1天(D1)。CTX+UC-MSC组D1、D4、D7、D10 尾静脉注射 UC-MSC(2X10^6/只),CTX 组和 CTX+UC-MSC 组D3腹腔注射CTX(200mg/kg)。Control组在相同时间以相同方式注射生理盐水。在D4、D7、D10、D13每组随机选取6只大鼠处死。3.1用化学分析法检测不同组血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的变化。3.2用生化学方法检测不同组肝、肾组织均浆中MDA、LPO、NO、T-SOD、GSH、GSH-PX 的表达。3.3检测肝、肾组织中凋亡相关蛋白基因和VEGFA基因表达从肝、肾组织中提取RNA,并用Real time qPCR法检测组织中凋亡相关蛋白基因(Bax和Bcl-2)和血管内皮生长因子(VEGFA)基因的表达。3.4病理学检查肝、肾组织固定后切片,行HE染色和免疫组化染色(α-SMA和Ki-67染色)。4.Wnt/β-catenin信号通路在UC-MSC治疗CTX导致的大鼠肾损伤中的作用提取肾组织蛋白,Western blot 法检测蛋白中 Wnt3、β-catenin、Axin2、occludin、内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)和平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的表达。结果1.UC-MSC的分离、培养和鉴定:脐带中分离培养的细胞呈漩涡样贴壁生长,流式细胞术示该细胞高表达CD44、CD73、CD90和CD105,低表达CD34和CD45,该细胞可向成骨、成脂、成软骨细胞特定分化,符合UC-MSC的定义,提示该细胞为UC-MSC。2.CTX导致大鼠肝、肾损伤模型的建立2.1与Control组相比,CTX组血清中ALT、AST、ALP、TBIL表达升高(P0.05),说明肝功能受损;BUN和肌酐的表达均升高(P0.05),这说明肾功能受损。2.2肝、肾组织均浆中,CTX组SOD、GSH和GSH-PX的表达低于Control组(P0.05),MDA、LPO和NO表达高于Control组(P0.05),说明肝肾均受到CTX导致的氧化应激损伤。2.3组织病理学观察,CTX诱导的肝脏组织肝索紊乱,肝细胞基质疏松淡染,呈气球样变,部分细胞内可见脂肪空泡,有的空泡较大将肝细胞核挤压靠近肝细胞膜呈月牙状,局部可见炎细胞浸润。CTX诱导的肾脏组织可见肾小球坏死,炎细胞浸润,出血,周围肾小管水肿。3.UC-MSC对CTX导致的大鼠肝、肾损伤的治疗作用3.1与CTX组相比,在任意时间点,UC-MSC处理后血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的表达均下降(P0.05)。3.2肝、肾组织均浆中,在任意时间点,CTX+UC-MSC组SOD、GSH和GSH-PX的表达高于CTX组(P0.05),MDA、LPO和NO表达低于CTX组(P0.05)。3.3 Real-time qPCR检测发现,与Control组相比,大鼠注射CTX后,肝、肾组织内Bax的mRNA表达上调,Bcl-2的mRNA表达下调(P0.05)。尾静脉注射UC-MSC后,Bax表达减少,Bcl-2表达增加(P0.05)。CTX+UC-MSC组肝、肾组织内VEGFA的mRNA表达远高于Control组和CTX组(P0.05)。3.4组织病理学改变:CTX诱导的肝脏组织肝索紊乱,肝细胞基质疏松淡染,呈气球样变。局部可见炎细胞浸润。部分细胞可见脂肪空泡使细胞核呈月牙状。UC-MSC预处理的大鼠肝脏病变程度轻于CTX组。腹腔注射CTX后,CTX+UC-MSC组大鼠肝脏恢复速度快于CTX组。CTX诱导的肾脏组织可见肾小球坏死,炎细胞浸润,出血,周围肾小管水肿。UC-MSC预处理的大鼠肾脏病变程度低于CTX组,尾静脉多次注射UC-MSC可加快肾损伤的恢复。3.5免疫组化:Control组未见α-SMA+细胞,CTX注射后,肝脏组织在D4可见散在α-SMA+细胞,D13时可见大量α-SMA+细胞,尾静脉注射UC-MSC后,肝脏切片α-SMA+细胞在各个时间点的表达均低于CTX组。Control组切片发现Ki-67+细胞散在分布于血管内壁,肝脏组织内未发现Ki-67+细胞。CTX组肝脏切片在血管附近和肝脏组织内可见散在少量Ki-67+细胞。UC-MSC处理后,Ki-67+细胞数量多于CTX组,多分布于肝脏组织内和大血管周围。大鼠肾脏组织中,Control组未见α-SMA+组织,CTX组在D10和D13肾小球内可见α-SMA+的纤维化组织,CTX+UC-MSC组内α-SMA+组织较CTX组少。在大鼠肾小管周围,Control组可见少量Ki-67+细胞,CTX组和CTX+UC-MSC组Ki-67+细胞数量增多,且UC-MSC处理后Ki-67+细胞多于CTX组。4.肾脏组织中,与CTX组相比,CTX+UC-MSC组Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白Wnt3、β-catenin和Axin2蛋白表达上调,连接蛋白occludin表达升高,VEGFR1表达增加,α-SMA+表达下降。结论:1.UC-MSC预处理可减轻CTX导致的大鼠肝、肾损伤,损伤后尾静脉多次注射UC-MSC可加速损伤的修复;2.UC-MSC治疗CTX导致的大鼠肾损伤可能是通过激活组织内经典Wnt/β-catenin信号通路实现的。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575;R692
【图文】：

图１人脐带间充质千细胞鉴定。Ａ为ｈＵＣ－ＭＳＣ形态学表现；Ｂ为流氏细胞逡逑学鉴定ｈＵＣ－ＭＳＣ；邋Ｃ为碱性磷酸酶染色；Ｄ为甲苯胺蓝染色；Ｅ为油红０染色。逡逑

图２邋ＣＴＸ正常大鼠与注射ＣＴＸ后大鼠大体改变及血清生化指标的比较。Ａ逡逑和Ｂ分别为正常大鼠和ＣＴＸ组大鼠；Ｃ为Ｃｏｎｔｒｏｌ组与ＣＴＸ组大鼠体重变化；逡逑Ｄ为两组大鼠肝脏／体重比率的比较；Ｅ为两组大鼠肾脏／体重比率的比较；Ｆ－Ｉ依逡逑血ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＴＢＩＬ的变化；Ｋ和Ｊ分别表示两组大逡逑

图３正常大鼠与ＣＴＸ组大鼠肝肾组织脏内氧化应激损伤指标的比较。Ａ－Ｆ逡逑表示Ｃｏｎｔｒｏｌ组与ＣＴＸ组大鼠肝脏组织均浆内氧化应激损伤指标的比较，依次为逡逑ＭＤＡ、ＬＯＰ、ＮＯ、ＳＯＤ、ＧＳＨ邋和邋ＧＳＨ－ＰＸ邋的比较；Ｇ－Ｌ邋表示邋Ａ－Ｆ邋表示邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑组与ＣＴＸ组大鼠肾脏组织均浆内氧化应激损伤指标的比较，依次为ＭＤＡ、ＬＯＰ、逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

本文编号：2764744