ASK3缺失对小鼠足细胞超微结构及功能的影响

发布时间：2020-07-22 14:10

【摘要】：背景与目的凋亡信号调节激酶 3(Apoptosis signal-regulating kinase,ASK3),是新近被证实的一种在肾脏高表达的蛋白激酶,在各物种间高度保守,又称丝裂素活化蛋白激酶激酶激酶 15(Mitogen activated protein kinase kinase kinase 15,MAP3K15)。前期工作中,我们发现了一个特发性膜性肾病家系,具有AK3移码突变,表现为肾病综合征,病理证实为膜性肾病,免疫组化染色证实肾脏ASK3表达减少。研究表明ASK3在肾脏中主要表达于肾小管上皮细胞,通过WNK1-SPAK/OSR1-NCC/NKCC通路调控细胞容量,无ASK3对肾小球功能影响的相关研究。上述通路中 Odd-skipped related trannscription factor(Osr1)是中间中胚层早期表达的基因,与足细胞发育关系密切,在肾脏等器官形成中起重要作用。因此我们拟通过ASK3敲除(ASK3 knockout,ASK3-KO)小鼠探索ASK3对足细胞结构和功能的作用;并探究ASK3缺失后,小鼠对阿霉素肾损害的易感性。研究方法1.对比9-10周龄雄性ASK3-KO小鼠、野生型(wild type,WT)小鼠,血压、尿蛋白、血尿电解质、血醛固酮、血生化指标、总肾重与体重比值,并在光镜下观察肾脏组织切片HE染色的改变,透射电镜下观察肾脏超微结构改变。2.对7-8周龄雌性ASK3-KO小鼠、WT小鼠尾静脉注射阿霉素(25mg/kg)诱导足细胞损害,对7-8周龄雌性ASK3-KO小鼠尾静脉注射生理盐水(12.5ml/kg)。观察ASK3-KO小鼠是否较WT小鼠更易在阿霉素诱导后出现蛋白尿。3.获取9-10周龄雄性ASK3-KO小鼠、WT小鼠的肾组织RNA,进行RNA-sequence及real-time PCR检测,比较离子通道基因、足细胞相关基因的mRNA表达水平差异。研究结果1.ASK3-KO小鼠收缩压显著升高,24小时尿钙总量明显减低,p0.05;血钠浓度、24小时尿钠总量、血醛固酮水平无明显差异。2.ASK3-KO小鼠肾重与体重的比值明显减低,p0.05。尿白蛋白肌酐比(albumin/creatinine ratio,ACR)无显著差异。光镜下肾脏HE染色下未见异常,电镜下见ASK3-KO小鼠肾脏存在足细胞足突局部融合。3.ASK3-KO小鼠中,第1天、第7天、第9天ACR,阿霉素注射组均显著高于生理盐水注射组,P0.05。注射阿霉素的ASK3-KO小鼠第7天ACR显著高于注射阿霉素的WT小鼠第7天ACR,p0.05。4.肾组织RNA sequence分析显示ASK3-KO组与WT组间共筛选出195个差异表达基因。尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(Plasminogen activator,urokinase receptor,PLAUR)基因在ASK3-K0组表达显著下调。足细胞相关基因OSR1、PAX2、WT1、NPHS1 NPHS2、SULT1B1 Synapo,WNK1-SPAK/OSR1-NCC/NKCC通路基因及相关离子通道基因SPAK、WNK1/3/4、NCC、NKCC1、NKCC2、ENaC、NHE3、SGLT1均非差异表达基因。5.Real-time PCR提示ASK3-KO组与WT组间肾脏OSR1及NCC、NKCC1、NKCC2、ENaC、NHE3、SGLT1 mRNA表达无明显差异,ASK3-KO组PLAUR表达明显下调,p0.05。结论我们首次证实ASK3-KO小鼠肾脏超微结构呈现足细胞足突局部融合;阿霉素注射后,ASK3-KO小鼠较WT小鼠更易出现蛋白尿。ASK3-KO小鼠肾脏PLAUR基因表达水平明显下调。为研究ASK敲除小鼠足细胞结构和功能研究提出了新线索。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

部分：缺失对小鼠足细胞超微结构和功能的影与方法逡逑验材料逡逑动物：逡逑因敲除小鼠的构建：ＡＳ７ＯＫ０小鼠获赠于日本东京大学药学研究院细胞信室Ｈｉｄｅｎｏｒｉ邋Ｉｃｈｉｊｏ教授。基因敲除小鼠构建方法为同源重组法１３，示图１。逡逑Ａ＾ａｌ逦Ａ＾ｉ逦叫逦Ａｐａ！逡逑

、ＸＳＸ３－Ｋ０小鼠体重、总肾重与体重比值逡逑ＡＳ／Ｇ－Ｋ０小鼠皮毛整齐光滑，活动自如，行为活泼，饮水进食无异常，体重随逡逑周龄增长而逐渐增加，生殖能力未见异常，见图２－Ａ。饲养时长最长至１８月龄，逡逑此时小鼠体型肥胖，活动尚可，饮水摄食无异常，外观未见明显异常。逡逑ＪＳＯ－ＫＯ组小鼠总肾重与体重的比值为０．０１４４邋±邋０．０００９，低于ＷＴ小鼠总肾逡逑重与体重的比值０．０１５９邋±邋０．０００８，并具有显著性差异，ｐ＜０．邋０５，见图２－Ｂ。逡逑Ａ逦０．０１８－Ｐ逦，邋Ｐ＿0Ｊ邋■，逡逑２８－ｊ逦二逦＊逡逑２０－逦？邋０．０１６－逦逦－＾５—逡逑ｆＺ逦Ｓ逦。逦卞逡逑尽１邋８－逦０．０１４－逦？？逡逑ｒ逦？逡逑ｏ－ｌ￣ｉ￣Ｉ￣Ｉ￣１￣Ｉ一一Ｉ￣１￣Ｉ——Ｉ逦０．０１２－Ｊ逦１逦１逦逡逑０１２３４５６７８９逦＾逡逑周数逦，逦，逡逑图２．邋Ａ．邋ＺＳ／Ｍ０小鼠体重随周龄变化（ｎ邋＝邋９）邋；邋Ｂ．小鼠总肾重与体重的比值逡逑（ＺＳ幻－Ｋ０邋小鼠，ｎ邋＝邋６；邋ＷＴ邋小鼠，ｎ邋＝邋７）逡逑二、小鼠血压水平逡逑１１逡逑

１５．８４邋）邋ｍｍＨｇ，高于同龄对照组（５１．２８邋±邋８．３７邋）邋ｍｍＨｇ，但无显著性差异。逡逑必幻－ＫＯ小鼠平均动脉压（８０．９５邋±邋１３．１１邋）邋ｍｍＨｇ，高于同龄对照组（７０．８８邋士逡逑５．３０邋）邋ｍｍＨｇ，但无显著性差异。见图３。逡逑ｐ邋＝邋０．００４逡逑１５０－１邋Ｉ邋Ｉ逡逑Ｔ逦0邋ＷＴ邋ｍｉｃｅ逡逑１２0？逦Ｉ逦？邋ＡＳＫ３－ＫＯ邋ｍｉｃｅ逡逑Ｉ邋＿邋ｉ逡逑Ｅ邋９０－逡逑１逦ｓ邋ｉ邋ｔ逡逑６０－逦ｊ逦0逡逑３０－＊逦１逦１逦１逦逡逑悐邋多邋？逡逑图３．邋／１ＳＯ－ＫＯ小鼠与ＷＴ小鼠收缩压、平均动脉压、舒张压（ｙ４ＳＯ－Ｋ０小鼠，ｎ邋＝逡逑６；邋ＷＴ邋小鼠，ｎ邋＝邋６）逡逑＊邋ＳＢＰ邋＝邋ｓｙｓｔｏｌｉｃ邋ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，邋文缩压；ＭＡＰ邋＝邋ｍｅａｎ邋ａｒｔｅｒｉａｌ邋ｂｌｏｏｄ逡逑ｐｒｅｓｓｕｒｅ，平均动脉压；ＤＢＰ邋＝邋ｄｉａｓｔｏｌｉｃ邋ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，舒张压；ＢＰ邋＝逡逑ｂｌｏｏｄ邋ｐｒｅｓｓｕｒｅ，血压逡逑三、ＡＳＤ－Ｋ０小鼠血尿电解质、血醛固酮水平逡逑ＪＳＯ－Ｋ０小鼠２４小时尿钙总量（１．６２邋土邋０．９６）邋ｎｍｏｌ明显低于ＷＴ小鼠（２．８８逡逑土邋０．邋６６）ｙｍｏｌ，ｐ＜０．邋０５。ＡＳ７Ｍ０小鼠血钙浓度稍高于野生型小鼠，但无显著性逡逑差异。ＡＳＡ３－Ｋ０小鼠与ＷＴ小鼠在血钠浓度、血氯浓度、血钾浓度、血磷浓度

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本文编号：2765919