尿外泌体中致纤维化基因表达在早期糖尿病肾病诊断中的作用研究

发布时间：2020-07-23 06:28

【摘要】：背景:随着人民生活水平的提升,目前糖尿病(diabetic mellitus,DM)的发病率逐年升高,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的最常见及最严重的并发症之一,发病率亦逐年升高。目前对于DN的诊断,在临床上一般需结合多年DM病史、临床表现为不同程度的白蛋白尿、合并DM的其他并发症(如糖尿病视网膜病变)等多方面指标来进行诊断,肾穿刺活检术作为诊断疾病的金标准,但由于其具有侵入性、损伤性等弊端,大多数DN患者较少接受此项检查。DN患者一旦出现大量白蛋白尿,其病变会快速进展,直至出现终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)。因此寻找相对更早期、更具有特异性的DN诊断指标具有重要价值。外泌体(exosome)作为一种细胞分泌的微小囊泡,携带大量生物学信息,而且外泌体具有的双层膜结构可以保护其内容物,使相关的生物学信息得以更加稳定的保存。目前已有许多文献报道,外泌体在多种疾病的诊断及治疗中具有重大的价值及意义。转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)均为致纤维化相关基因,在DN的发生及进展过程中起到重要作用,而且多种研究表明,上述两种因子与足细胞损伤、系膜细胞增殖、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积等有密切的关系。目前已有研究通过比较DN患者和健康者血清或尿液中TGF-β1和CTGF基因的含量,发现DN患者血清或尿液中TGF-β1和CTGF基因表达升高,推测其表达对于早期诊断DN具有重要的意义。在本研究中通过检测尿液外泌体中TGF-β1和CTGF基因的含量,寻找与DN之间的关系,为DN的早期诊断提供新的思路。目的:研究早期DN患者尿液外泌体中的致纤维化基因TGF-β1、CTGF的基因表达水平与健康人组的差异,以期发现早期DN的诊断标记物。方法:本研究纳入健康体检者和早期DN患者各30例,收集入选者性别、年龄、吸烟史等一般资料,高血压病史、收缩压、舒张压、蛋白尿、血尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、血胱氨酸蛋白酶抑制剂C、血红蛋白等临床资料,将一般资料与临床资料整理后进行统计学分析。所有入选者均留取晨尿400ml,应用差速超速离心法分离提取尿液中的外泌体,通过透射电镜法(transmission electron microscope,TEM)、蛋白免疫印迹法(western blot,WB)鉴定外泌体。利用实时定量PCR法(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)检测尿液外泌体中TGF-β1和CTGF的m RNA相对表达量,蛋白免疫印迹法检测TGF-β1和CTGF的蛋白相对表达量。所有数据均应用SPSS19.0进行统计学分析,用Graphpad prism 6.0进行制图,p0.05视为有统计学意义。结果:1.健康体检者共30例,男性14例(46.67%),女性16例(53.33%),男:女=0.875:1,平均年龄为51.57±7.81岁,DN组患者共30例,男性21例(70.00%),女性9例(30.00%),男:女=2.33:1,平均年龄为54.9±9.15岁,两组在性别、年龄比较差异无统计学意义。与健康体检者比较,DN组患者的高血压病史、收缩压、舒张压、蛋白尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖、血尿素氮水平明显升高(p0.05)。2.健康体检者及DN患者尿液经差速超速离心后,所得样本在电镜下观察呈现为类圆形、直径约40-100nm的“杯状小体”,在WB实验中,外泌体标记性蛋白CD9及TSG101蛋白呈阳性。3.与健康体检组比较,DN组患者尿液外泌体中TGF-β1基因m RNA水平、蛋白含量明显升高(p0.001)。4.与健康体检组比较,DN组患者尿液外泌体中CTGF基因m RNA水平、蛋白含量明显升高(p0.001)。结论:1.利用差速超速离心法,可从健康体检者及早期DN患者尿液中成功分离出外泌体。2.DN组患者尿液外泌体中TGF-β1、CTGF的基因m RNA水平及蛋白含量均明显高于健康体检组,提示尿液外泌体中TGF-β1及CTGF的基因表达水平可以作为早期DN的诊断指标。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

尿液,鉴定图,电镜,空腹血糖

压、蛋白尿、糖尿、尿微量白蛋白、空腹血糖（p<0.05）。DN 组患者的空腹血糖为 9.83±2.mHg，舒张压 89.50±12.10mmHg。将尿微量白液外泌体中的 TGF-β1、CTGF 的 mRNA 及蛋性回归分析，并无明显相关性（p>0.05）。具的鉴定速-超速离心法将外泌体从尿液中分离，得到行鉴定。鉴定外泌体沉淀置于透射电子显微镜下，观察外泌体的形小体”，直径大约在 40-100nm 之间，如图 4.2.

尿液,特异性,体标记,蛋白S

、“杯口状小体”，直径大约在 40-100nm 之间，如图 4.2.1。Western-Blot 法鉴定尿液外泌体标记蛋白SG101 及 CD9 为外泌体特异性标志蛋白，应用 TSG101 及 CD9 单一抗，可得到如图 4.2.2 中的条带，证明样品中存在外泌体。图 4.2.1 尿液外泌体的电镜鉴定图片

熔解曲线,内参,对数图,基因

25图 4.3 A 为内参基因 GAPDH 的扩增曲线对数图， B 为内参基因 GAPDH 的熔解曲线图，C 为目的基因 TGF-β1 的扩增曲线对数图， D 为目的基因 TGF-β1 的熔解曲线图， E 为目的基因 CTGF 的扩增曲线对数图， F 为目的基因 CTGF 的熔解曲线图。

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