尿液游离microRNAs作为膀胱癌早期诊断和分期预测标志物的实验及临床研究

发布时间：2020-07-24 08:47

【摘要】：研究背景膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中均居首位,严重威胁人类健康。临床上,膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌层浸润性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物学特性及采用的治疗方案显著不同。非肌层浸润性膀胱癌又称为表浅性膀胱癌,首选经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)进行微创治疗,预后相对较好;而肌层浸润性膀胱癌恶性程度高,发生转移早,预后较差,5年生存率仅为50-60%,其标准治疗方案则是采用根治性膀胱切除术同时行盆腔淋巴结清扫术。膀胱癌患者初诊时30%已发生肌层浸润,而在非肌层浸润性膀胱癌患者中,仍有30%会复发为浸润性膀胱癌。对膀胱癌进行早期诊断并对肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌进行术前有效鉴别是膀胱癌治疗方案选择的关键。目前临床上诊断膀胱癌主要依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学和影像学检查等。膀胱镜是膀胱癌诊断的常用方法,可造成不同程度的尿道和膀胱损伤以及感染等并发症;尿脱落细胞学检查具有非侵入性、特异性高等优点,但其敏感性低于50%,对早期患者仅为30%,易受检测者主观因素的影响;CT和超声检查是目前诊断膀胱癌及术前分期最常用的影像学检查方法,但不易发现膀胱内微小病变,使其对膀胱癌分期预测的价值受到一定限制;TUR-BT主要用于非肌层浸润性膀胱癌的治疗,同时也可为肌层浸润性膀胱癌提供分期依据,但由于手术本身的风险及依从性差限制了其在膀胱癌分期预测上的广泛应用。寻找敏感性、特异性高的新型生物标志物用于膀胱癌早期发现并对肌层浸润性膀胱癌进行术前预测仍是目前关注的焦点。MicroRNAs (miRNAs)通过与靶mRNA分子完全或不完全配对结合从而在转录后水平调控基因的表达,在肿瘤发生发展调控网络中扮演着至关重要的角色。对不同类型肿瘤中的miRNAs分析发现,miRNAs表达谱具有明显的肿瘤特异性,并且在肿瘤的不同分期中其也具有特定的表达模式,提示其可作为肿瘤诊断及分期预测的潜在标志物。近年研究表明,尿液上清中存在丰富且稳定的miRNAs,其与泌尿系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关,为肿瘤的无创诊断提供了新思路。筛选鉴定尿液游离miRNAs表达谱并引入构建模型从而用于膀胱癌的无创性诊断和肌层浸润性膀胱癌的预测,将有助于膀胱癌的早期发现及临床治疗方案的选择。RT-qPCR是目前miRNAs定量检测最常用的技术手段,其检测数据标准化主要选用内参基因进行校正。采用一种最适的内参基因来对miRNAs的表达量进行校正可以提高RT-qPCR检测的重复性和灵敏度。对于膀胱癌尿液游离miRNAs RT-qPCR定量检测,目前尚无最适内参基因系统筛选的相关研究。鉴于此,本课题首先采用高通量测序技术结合RT-qPCR技术系统筛选并确定可用于尿液游离miRNAs定量检测的最适内参基因;以筛选的最适内参基因为参照,进一步筛选膀胱癌特异尿液游离miRNAs差异表达谱,结合logistic回归分析构建膀胱癌诊断模型并评价其在膀胱癌早期诊断中的应用价值;同时,采用上述技术手段系统筛选对肌层浸润性膀胱癌有预测价值的尿液miRNAs差异表达谱,结合logistic回归分析构建膀胱癌分期预测模型并评价其在肌层浸润性膀胱癌预测中的应用价值;最后通过膀胱癌组织样本检测及体外细胞实验,研究相关miRNAs分子在膀胱癌中的生物学功能。本研究将建立基于尿液游离miRNAs新型生物标志物的膀胱癌诊断和分期预测模型,为膀胱癌的无创诊断及分期预测开辟新途径,并为膀胱癌的有效治疗提供新靶点。第一部分膀胱癌尿液microRNAs RT-qPCR检测最适内参基因的选择与验证研究目的实时荧光定量PCR (RT-qPCR)是目前尿液游离microRNAs (miRNAs)检测最常用的方法,选择合适的内参基因进行数据标准化是获得可信RT-qPCR定量数据的重要保证。本研究旨在对膀胱癌尿液游离miRNAs RT-qPCR检测的内参基因进行系统筛选和验证,确定可用于膀胱癌尿液游离miRNAs RT-qPCR检测的最适内参基因。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康对照尿液上清,采用Miseq高通量测序技术对两组样本进行分析,选择拷贝数大于50,在两组样本中表达无差异且在两组之间倍数小于1.2的miRNAs分子作为候选的内参基因。2.采用RT-qPCR技术在80例膀胱癌和80例健康对照尿液上清中对测序筛选出的候选内参基因和目前常用内参基因U6 snRNA进行初步验证。3.利用NormFinder和geNorm软件评估内参基因的表达稳定性,确定最适的内参基因。4.采用RT-qPCR技术在63例膀胱癌和63例健康对照尿液上清中对筛选确定的最适内参基因进行评估。结果1.候选内参基因的测序筛选:膀胱癌组和健康对照者组比较发现,根据筛选标准,拷贝数大于50,两组间表达无差异且两组倍数小于1.2的miRNAs分子为 13 个(let-7b-5p、miR-532-5p、miR-23b-5p、miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-194-5p、miR-30b-5p、miR-98-5p 和miR-99b-5p),同时也将U6 snRNA作为候选内参基因纳入进行下一步验证。2.候选内参基因的RT-qPCR验证:在上述14个候选的内参基因中,有4个 miRNAs 分子(miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-30b-5p和miR-98-5p)在尿液上清标本中无法检测到;2个miRNAs分子(miR-194-5p和miR-99b-5p)的RT-qPCR 检测的平均 Cq 值大于 35; 7 个 miRNAs (miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-23b-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-532-5p 和 let-7b-5p)和 U6 snRNA在所有尿液上清样本中均可检测到且Cq均值小于35。3.确定的内参基因的表达稳定性评估:利用NormFinder和geNorm两个软件评估上述7个确定的miRNAs分子和U6 snRNA的稳定性,两个软件均显示let-7b-5p是表达最稳定的内参基因,let-7b-5p和miR-532-5p组合是最稳定的内参基因组合。4.最适内参基因的验证:运用另外一组独立的样本(63例膀胱癌和63例健康对照尿液上清标本)进行最适内参基因的验证,结果显示let-7b-5p、miR-532-5p及let-7b-5p和miR-532-5p组合在膀胱癌组和健康对照组两组间表达均无差异(均P0.05),在不同分期的膀胱癌患者中表达也无差异(均P0.05)。结论let-7b-5p和miR-532-5p组合可作为膀胱癌和健康对照尿液游离miRNAs RT-qPCR检测的最适内参基因。第二部分基于尿液microRNAs表达谱的膀胱癌诊断模型的构建及临床应用研究目的膀胱癌在我国的发病率和死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤的首位,且呈逐年上升趋势。目前临床上诊断膀胱癌的主要技术手段仍依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学检测和影像学检查等,它们虽各有优势,但或具侵入性,或依从性差,或敏感性和特异性不足,尚无法满足临床需求。研究发现,尿液上清中存在丰富而稳定的游离microRNAs (miRNAs),其与泌尿系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关,为肿瘤的无创性诊断开辟了一条新的途径。本研究旨在系统筛选膀胱癌特异尿液游离miRNAs表达谱,进一步运用logistic回归分析构建基于尿液游离miRNAs的膀胱癌诊断模型用于膀胱癌的诊断。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康对照尿液上清,采用Miseq高通量测序技术对两组样本进行分析,选择在两组样本中表达呈显著差异且两组之间倍数大于2的miRNAs作为候选miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技术在150例膀胱癌和150例健康对照尿液上清中对上一步测序筛选出的候选miRNAs分子进行验证。并采用受试者工作曲线(ROC)评估验证后的呈差异表达的miRNAs分子对膀胱癌的诊断效能。3.通过logistic回归分析将验证出的对膀胱癌具有诊断价值的miRNAs分子构建膀胱癌诊断模型。4.采用RT-qPCR技术在另外一组独立样本(120例膀胱癌和120例健康对照)尿液上清中对膀胱癌诊断模型进行验证。同时检测上述240例受试者的尿液脱落细胞学,并比较尿液脱落细胞学检测和诊断模型对膀胱癌的早期诊断价值。5.采用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis检验统计分析上述具有诊断价值的miRNAs分子的表达与膀胱癌患者临床病理参数之间的相关性。6.采用单因素Kaplan-Meier分析方法,对膀胱癌患者的复发情况进行分析,并用log-rank test统计比较上述miRNAs分子与膀胱癌复发的关系。进一步采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型评估miRNAs分子在膀胱癌复发中的预测价值。结果1.差异miRNAs测序筛选:高通量测序结果显示,膀胱癌和健康对照尿液上清中拷贝数大于50的miRNAs分子分别为256和308个。在两组间表达呈显著差异且倍数大于2的miRNAs分子为23个,其中在膀胱癌组中呈高表达的为16 个,分别为:let-7e-5p、let-7i-5p、miR-7-5p、miR-22-3p、miR-23a-3p、miR-29a-3p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-148a-3p、miR-184-5p、miR-181b-5p、miR-186-5p、miR-221-3p、miR-375、miR-574-5p和miR-941;在膀胱癌组中呈低表达的为7个,分别为:miR-10a-3p、miR106b-5p、miR-200a-3p、miR-423-5p、miR-429、miR-455-5p 和 miR-505-3p。2.差异miRNAs分子的RT-qPCR验证:将上述23个呈差异表达的miRNAs分子在150例膀胱癌和150例健康对照尿液上清中进行RT-qPCR检测验证,结果显示 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p 和 miR-375 在膀胱癌组的表达显著高于健康对照组(均P0.05),miR-200a-3p和miR-423-5p在膀胱癌组的表达显著低于健康对照组(均P0.05)。ROC曲线评估尿液上清游离miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p 和miR-423-5p诊断膀胱癌的曲线下面积(AUC)分别为:0.639、0.803、0.67、0.705、0.748、0.692 和 0.72。3.膀胱癌诊断模型的构建:运用logistic回归分析将上述7个miRNAs分子构建基于尿液游离miRNAs的膀胱癌诊断模型,得到膀胱癌的判别公式为:logit(p=BC)=-0.7792-(0.0823×miR-7-5p)-(0.2015×miR-22-3p)-(0.0223×miR-29a-3p)-(0.0793×miR-126-5p)+(0.1522×miR-200a-3p)-(0.1545×miR-375)+(0.2234×miR-423-5 p),该模型诊断膀胱癌的AUC为0.923 (95% CI: 0.886～0.950),敏感性为82%,特异度为96%。4.膀胱癌诊断模型的验证:在另外一组独立样本(120例膀胱癌和120例健康对照)尿液上清中验证发现,7-miRNAs诊断模型诊断膀胱癌的AUC为0.916(95% CI: 0.873～0.948),敏感性为85.00%,特异度为86.67%。诊断模型对Ta期膀胱癌的诊断AUC为0.864,敏感性为81.25%,特异度为85.00%;对T1期膀胱癌的诊断AUC为0.930,敏感性为89.74%,特异度为86.67%;对T2-T4期膀胱癌的诊断AUC为0.978,敏感性为97.78%,特异度为90.83%。膀胱癌诊断模型对低级别膀胱癌的诊断AUC为0.911,敏感性为80.88%,特异度为91.67%;对高级别膀胱癌的诊断AUC为0.958,敏感性为94.23%,特异度为89.17%。另外,传统尿液脱落细胞学检测对膀胱癌的诊断AUC为0.642 (95% CI: 0.577～0.702),敏感性为30.83%,特异度为97.50%。其对Ta、T1和T2-T4期膀胱癌的诊断AUC分别为0.531、0.628和0.724。结果显示诊断模型对膀胱癌的诊断效能显著优于传统尿液脱落细胞学检测。5. miRNAs分子表达与膀胱癌患者临床病理参数的相关性:结果显示,膀胱癌患者尿液游离miR-22-3p和miR-375表达上调以及miR-423-5p表达下调与患者较高的临床分期显著相关(P=0.02, P=0.03和P=0.03); miR-29a-3p和miR-375表达上调与患者局部淋巴结转移状态显著相关(P=0.03和P=0.04); miR-7-5p的高表达与患者较高的病理分级显著相关(P=0.02)。6. miRNAs分子表达与膀胱癌患者复发的相关性:分别对非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的患者进行随访,Kaplan-Meier生存曲线分析显示,尿液游离miR-22-3p高表达的非肌层浸润性膀胱癌患者的五年无复发生存率显著低于miR-22-3p低表达的患者(P=0.002)。尿液游离miR-200a-3p低表达的非肌层浸润性膀胱癌患者五年无复发生存率低于miR-200a-3p高表达的患者(P=0.040)。miR-7-5p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375 和 miR-423-5p 的表达水平与非肌层浸润性膀胱癌的复发无相关性。单因素Cox比例风险回归模型分析显示miR-22-3p、miR-200a-3p和临床分期为非肌层浸润性膀胱癌复发的预测因子(P= 0.004,P=0.045和P=0.006)。多因素Cox比例风险回归模型分析显示miR-22-3p、miR-200a-3p和临床分期均为非肌层浸润性膀胱癌复发的独立预测因子(P=0.024, P=0.008和P=0.008)。另外,上述miRNAs分子的表达水平与肌层浸润性膀胱癌的复发均无相关性。结论尿液游离 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p和miR-423-5p可以作为潜在肿瘤标志物用于膀胱癌的诊断,构建的7-miRNAs诊断模型能够用于膀胱癌的早期诊断,并且显著优于传统尿液脱落细胞学检测:miR-22-3p和miR-200a-3p为非肌层浸润性膀胱癌复发的独立预测因子。上述结果为膀胱癌的无创性诊断和非肌层浸润性膀胱癌的复发预测提供了一条的新的途径。第三部分:基于尿液microRNAs表达谱的膀胱癌分期预测模型的构建及临床应用研究目的临床上膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌层浸润性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物学特性及采用的临床治疗方案显著不同。非肌层浸润性膀胱癌又称表浅性膀胱癌,首选经尿道膀胱肿瘤切除术进行微创治疗,预后相对较好;而肌层浸润性膀胱癌恶性程度高,发生转移早,预后较差,5年生存率仅为50-60%,其标准治疗方案则是采用根治性膀胱切除术同时行盆腔淋巴结清扫术。术前对肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌进行有效鉴别是治疗方案选择的关键,同时也是目前临床亟待解决的难题。本研究旨在筛选肌层浸润性膀胱癌特异尿液游离miRNAs表达谱,进而采用logistic回归分析构建基于尿液游离miRNAs的膀胱癌分期预测模型用于肌层浸润性膀胱癌的术前预测。方法1.收集6例肌层浸润性膀胱癌、6例非肌层浸润性膀胱癌和6例健康对照尿液上清,采用Miseq高通量测序技术对三组样本进行分析,初步筛选差异表达miRNAs作为候选miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技术在113例肌层浸润性膀胱癌、113非例肌层浸润性膀胱癌和156例健康对照尿液上清中对测序筛选出的候选miRNAs分子进行验证。确定肌层浸润性膀胱癌特异的miRNAs分子,采用受试者工作曲线(ROC)评估上述特异的miRNAs分子对肌层浸润性膀胱癌的预测效能。3.运用logistic回归分析将验证出的对肌层浸润性膀胱癌具有预测价值的miRNAs分子构建膀胱癌分期预测模型。4.采用RT-qPCR技术在另外一组独立样本(102例非肌层浸润性膀胱癌和83例肌层浸润性膀胱癌)尿液上清中对膀胱癌分期预测模型进行验证。同时检测上述185例膀胱癌患者的尿液脱落细胞学,并统计膀胱癌病理分级信息,比较尿液脱落细胞学检测、病理分级和膀胱癌预测模型三者对肌层浸润性膀胱癌的预测效能。5.采用单因素Kaplan-Meier分析方法,对肌层浸润性膀胱癌的预后进行分析,并用log-rank检验统计比较上述miRNAs分子与肌层浸润性膀胱癌预后的关系。进一步采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型评估miRNAs分子在肌层浸润性膀胱癌预后中的独立预测价值。结果1.差异miRNAs测序筛选:高通量测序结果显示,大于50个拷贝的miRNAs分子在肌层浸润性膀胱癌中为235个,非肌层浸润性膀胱癌中为188个,健康对照者中为276个。根据筛选标准,大于50拷贝,在三组之间两两表达呈显著差异且倍数大于 2 的 miRNAs分子为 24个:let-7a-5p、let-7b-5p、miR-1、miR-100-3p、miR-126-5p、miR-133a、miR-143-3p、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-186-5p、miR-194-5p、miR-200a-5p、miR-22-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-28-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-320a、miR-34a-5p、miR-375和 miR-1246。2.候选miRNAs分子的RT-qPCR验证:将上述24个差异表达的miRNAs分子在113例肌层浸润性膀胱癌、113例非肌层浸润性膀胱癌和156例健康对照中尿液上清中进行RT-qPCR验证,结果显示miR-24-3p和miR-1246在肌层浸润性膀胱癌组表达显著高于非肌层浸润性膀胱癌组和健康对照组(均P0.05),同时,其在非肌层浸润性膀胱癌组表达显著高于健康对照组(均P0.05)。ROC分析显示,miR-24-3p和miR-1246预测肌层浸润性膀胱癌的曲线下面积(AUC)分别为0.791和0.675。3.膀胱癌分期预测模型的构建:将上述2个miRNAs分子构建基于尿液游离miRNAs的膀胱癌分期预测模型,得到肌层浸润性膀胱癌的判别公式为:logit(p=MIBC)=0.8575—0.2156×miR-24-3p-0.2133×miR-1246,该分期预测模型对肌层浸润性膀胱癌的预测AUC为0.825(95% CI: 0.769～0.872),敏感性为76.11%,特异度为74.34%。4.膀胱癌分期预测模型的验证:在另外一组独立样本中进一步验证发现,分期预测模型预测肌层浸润性膀胱癌的AUC为0.808 (95% CI: 0.744～0.862),敏感性为75.9%,特异度为75.49%,显著高于临床分级(AUC: 0.709, 95%CI:0.638～0.773)和尿液脱落细胞学检测(AUC: 0.561, 95% CI: 0.487～0.634)。5. miRNAs分子表达与肌层浸润性膀胱癌患者预后的相关性:对肌层浸润性膀胱癌的患者进行预后随访,Kaplan-Meier生存曲线分析显示,尿液游离miR-24-3p高表达的肌层浸润性膀胱癌患者的五年生存率显著低于miR-24-3p低表达的患者(P0.05)。miR-1246的表达与肌层浸润性膀胱癌患者的预后无相关性。单因素Cox比例风险回归模型分析显示miR-24-3p和临床分期为肌层浸润性膀胱癌预后判断因子(P= 0.008和P=0.008)。多因素Cox比例风险回归模型分析显示miR-24-3p和临床分期均为肌层浸润性膀胱癌预后的独立判断因子(P=0.004和 = 0.014)。结论尿液游离miR-24-3p和miR-1246可以作为潜在肿瘤标志物用于膀胱癌的分期预测,构建的2-miRNAs膀胱癌分期预测模型能够在术前预测肌层浸润性膀胱癌,并且显著优于传统尿液脱落细胞学检测和病理分级;miR-24-3p为肌层浸润性膀胱癌预后的独立判断因子。上述结果为肌层浸润性膀胱癌的术前预测和预后判断提供了一条的新的途径。第四部分:microRNAs分子在膀胱癌组织中表达及生物学功能研究研究目的本研究旨在检测膀胱癌分期预测模型中的microRNAs (miRNAs)分子在肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌组织中的表达情况。通过体外调控膀胱癌细胞系中miRNAs分子的表达水平,进行相关细胞功能实验,探讨上述miRNAs分子在膀胱癌增殖、迁移、侵袭及凋亡等过程中的生物学功能,明确其在膀胱癌发生发展中的作用,为寻找膀胱癌潜在的治疗靶点提供理论依据。方法1.采用RT-qPCR技术检测35例肌层浸润性膀胱癌及35例非肌层浸润性膀胱癌新鲜冰冻组织及T24膀胱癌细胞系中miR-24-3p和miR-1246的表达情况。选取差异表达miRNAs分子,进一步检测其在肌层浸润性膀胱癌组织及配对癌旁正常组织中的表达情况。2.体外用脂质体2000将miR-1246 mimics、miR-1246 inhibitor和对应的阴性对照序列转染T24膀胱癌细胞系,同时利用RT-qPCR方法检测转染效率。3.采用CCK8实验、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验及Annexin V-FITC/PI双标流式细胞学实验检测转染后T24膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的变化。结果1.结果显示,miR-1246在肌层浸润性膀胱癌组织中的表达水平显著高于非肌层浸润性膀胱癌组织(P0.05),而miR-24-3p表达在肌层浸润性膀胱癌组织与非肌层浸润性膀胱癌组织之间差异无统计学意义(P0.05)。进一步检测miR-1246在肌层浸润性膀胱癌组织与配对癌旁正常组织的表达情况,结果显示相比配对癌旁正常组织,77%的肌层浸润性膀胱癌组织中miR-1246的表达水平显著上调(大于2倍)。2.相比于mock组和miR-NC组,转染miR-1246mimics24小时后,T24膀胱癌细胞中miR-1246的表达水平显著上调(P0.001)。相比于mock组和miR-NC组,转染miR-1246 inhibitor24小时后,T24膀胱癌细胞中miR-1246的表达水平显著下调(P 0.05)。3.相比于mock组和miR-NC组,转染miR-1246 mimics的T24膀胱癌细胞在转染后48小时、72小时、96小时增殖均明显增快,差异具有统计学意义(P0.05)。相比于 mock 组和 miR-NC 组,转染 miR-1246 inhibitor 的 T24 膀胱癌细胞在转染48小时、72小时、96小时后增殖明显减慢,差异具有统计学意义(P0.05)。4.划痕实验显示,转染24小时后,miR-1246mimics组愈合率显著高于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05); miR-1246inhibitor组愈合率明显低于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05)。Transwell迁移实验显示,T24膀胱癌细胞miR-1246mimics组穿膜细胞数明显高于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05); T24膀胱癌细胞miR-1246inhibitor组穿膜细胞数明显低于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05)。Transwell侵袭实验显示,T24膀胱癌细胞miR-1246mimics组穿膜细胞数明显高于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05); T24膀胱癌细胞miR-1246inhibitor组穿膜细胞数明显低于mock组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P0.05)。5.细胞凋亡实验显示,T24膀胱癌细胞miR-1246mimics组凋亡率与mock组和miR-NC组相比,差异无统计学意义(P0.05)。另外,T24膀胱癌细胞miR-1246inhibitor组凋亡率与mock组和miR-NC组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论相比于非肌层浸润性膀胱癌,miR-1246在肌层浸润性膀胱癌组织中表达水平显著上调。进一步体外细胞功能实验发现,miR-1246在膀胱癌细胞增殖、侵袭及转移等恶性生物学行为中发挥重要作用,显著促进膀胱癌进展。本研究将为寻找膀胱癌新的治疗靶点提供理论依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.14
【图文】：

图１．候选内参基因的Ｃｑ值逡逑膀胱癌组和健康对照组两组间８个候选内参基因表达的Ｃｑ值，８个在两组间表达无差异（＾＞０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ＢＣｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｒｏｌｓ．邋Ｎｏ邋ｓｉｇｎｆｅｒｅｎｃｅ邋ｗａｓ邋ｆｏｕｎｄ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｇｒｏｕｐｓ邋（＾＞

图２．邋ＲＯＣ曲线分析ｍｉＲ－２４－３ｐ对肌层浸润性膀胱癌的预测效能，训练组（ａ）和逡逑验证组（ｃ）；邋ＲＯＣ曲线分析ｍｉＲ－１２４６对肌层浸润性膀胱癌的预测效能，训练组逡逑（ｂ）和验证组（ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２４－３ｐ邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ）邋ａｎｄ逡逑ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｃ）；邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１２４６邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ逡逑（ｂ）邋ａｎｄ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｄ）．逡逑

图３．逦（ａ）邋ＲＯＣ曲线分析２－ｍｉＲＮＡｓ预测模型对肌层浸润性膀胱癌的预测效（训练组）；（ｂ）邋ＲＯＣ曲线分析２－ｍｉＲＮＡ预测模型对肌层浸润性膀胱癌的预效能（验证组）；（ｃ）病理分级对肌层浸润性膀胱癌的预测效能；（ｄ）尿液脱细胞学对肌层浸润性膀胱癌的预测效能。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮＡ邋ｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ），邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｂ），邋ｇｒａｄｅ邋（ｃ）邋ａｎｄ邋ｕｒｉｎａｒｙ邋ｃｙｔｏｌｏｇｙ邋（ｄ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．逡逑

本文编号：2768600