巨噬细胞对糖尿病肾病足细胞凋亡的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-24 09:15

【摘要】：目的:足细胞凋亡是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)足细胞损伤的早期中心环节。巨噬细胞浸润是糖尿病肾病的重要特征,在糖尿病肾病发生发展中发挥着至关重要的作用。然而,巨噬细胞对DN足细胞凋亡的作用目前尚不清楚。本研究通过构建STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型及体外巨噬细胞和足细胞共培养两方面,观察糖尿病肾病状态下活化的巨噬细胞对足细胞凋亡的作用,并探讨其内在的细胞生物学机制。方法:动物实验:将SD雄性大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病(DN)组。利用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)一次性腹腔注射建立DN模型,建模后18w末处死动物,留取血、尿、肾组织标本,检测血糖、血肌酐(serum creatinine,Scr)、24小时尿蛋白变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling,Tunel)检测肾组织足细胞凋亡,免疫组化法检测肾组织CD68~+巨噬细胞浸润,8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)染色检测肾组织氧化应激产物活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot检测肾组织p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38MAPK)蛋白表达。细胞实验:1.Transwell共培养巨噬细胞(Raw264.7)与足细胞(MPC),取Raw264.7巨噬细胞以2×10~5,4×10~5,8×10~5/孔浓度接种于6孔板Transwell的上室滤膜上培养并同步化,同时取MPC足细胞以4×10~5/孔浓度接种于6孔板培养并同步化,随后将上述含有Raw264.7巨噬细胞的上室放入含有MPC足细胞的六孔板中培养,在此共培养体系中加或不加25 mM高葡萄糖(High glucose,HG)或者25mM甘露醇(Mannitol,Man)培养48h。2.首先体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,将其分为三组:正常葡萄糖组(NC)、甘露糖组(Man)、高葡萄糖组(HG),24h后PBS清洗后予以正常培养基培养24h后收集上述NC组巨噬细胞上清液(NC-CM)和HG组巨噬细胞上清液(HG-CM)。采用Western blot和免疫荧光染色检测M1型巨噬细胞标志物(inducible Nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis facto-α,TNF-α)和M2型巨噬细胞标志物(Mannose receptor,MR)表达,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测巨噬细胞上清液TNF-α水平。其次,体外培养小鼠永生系足细胞MPC5,将其分为以下几组:正常葡萄糖对照组(NC),NC-CM组,HG-CM组,HG-CM+ROS抑制剂组(HG-CM+Tempo),HG-CM+p38MAPK抑制剂组(HG-CM+SB203580),HG-CM+抗TNF-α中和抗体组(HG-CM+TNF-αneutralizing antibody),HG-CM+中和抗体对照剂IgG组(HG-CM+IgG),重组小鼠TNF-α组。采用Annexin V-FITC/PI和Hoechst33342染色检测足细胞凋亡率,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)染色检测足细胞ROS水平,Western blot检测足细胞cleaved casepase-3、p38MAPK和p-p38MAPK表达。结果:1.与正常对照组相比,DN组大鼠血糖水平明显增加,体重下降,Scr水平和24小时尿蛋白明显增加。与对照组相比,DN组大鼠肾组织足细胞凋亡数量明显增加,肾组织CD68~+巨噬细胞浸润数量明显增加。为进一步探讨糖尿病肾病状态下巨噬细胞对足细胞凋亡的作用,建立体外巨噬细胞和足细胞Transwell共培养。结果发现,与对照组相比,高糖能增加足细胞凋亡,促进足细胞凋亡蛋白cleaved casepase-3蛋白表达。在高糖条件下的Transwell共培养体系中,巨噬细胞能显著增加高糖诱导的足细胞凋亡,进一步上调足细胞cleaved casepase-3蛋白表达,呈细胞数量依赖性。但是,在正常浓度葡萄糖条件下的Transwell共培养体系中,足细胞未发生凋亡反应。这提示巨噬细胞可能在高糖坏境下发生活化后加重足细胞凋亡。进一步研究发现,巨噬细胞在高糖刺激后呈促炎性M1型活化,高表达M1型巨噬细胞特异性标志物iNOS,而M2型细胞标志物MR表达明显减少。收集正常葡萄糖培养的巨噬细胞上清液NC-CM和高糖培养的巨噬细胞上清液HG-CM并以此干预足细胞,结果发现,正常对照组与NC-CM组两组在各个时间点足细胞凋亡水平差异无统计学意义。与对照组和NC-CM组相比,HG-CM组足细胞凋亡明显增加,呈时间依赖性。2.与正常对照组相比,DN大鼠肾小球ROS水平增加,肾组织p38MAPK活化水平即p-p38MAPK蛋白表达增多,p-p38MAPK/p38 MAPK比值明显上调。体外细胞实验发现,与正常对照组(NC)和NC-CM组相比,HG-CM组足细胞ROS水平明显增加,足细胞p-p38MAPK蛋白表达增多,p-p38MAPK/p38MAPK比值上调。ROS阻断剂Tempo能阻断HG-CM诱导的足细胞凋亡,减轻足细胞cleaved caspase-3蛋白表达,同时抑制足细胞p-p38MAPK活化,降低p-p38MAPK蛋白表达和p-p38MAPK/p38MAPK比值。p38 MAPK蛋白活化抑制剂SB203580能显著降低HG-CM诱导的足细胞凋亡,抑制足细胞cleaved caspase-3蛋白表达。3.与巨噬细胞NC-CM上清液相比,巨噬细胞HG-CM上清液中TNF-α显著升高。Western印迹结果显示,巨噬细胞予以高糖刺激后,TNF-α蛋白表达明显增加。与HG-CM组相比,抗TNF-α中和抗体能显著减少HG-CM诱导的足细胞凋亡,降低cleaved caspase 3蛋白表达,同时下调HG-CM诱导的足细胞ROS产生,降低足细胞p-p38MAPK蛋白表达和p-p38MAPK/p38 MAPK比值。足细胞予以重组小鼠TNF-α单独刺激后,其凋亡数量明显增加,cleaved caspase 3蛋白表达显著增加,ROS产生明显增多,p-p38MAPK蛋白表达和p-p38MAPK/p38MAPK比值上调。结论:1.糖尿病肾病大鼠肾组织足细胞凋亡数量明显增加,伴随着巨噬细胞浸润显著增多。2.高糖能诱导巨噬细胞发生促炎性M1型巨噬细胞活化,该M1型巨噬细胞激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路进而诱导足细胞凋亡。3.高糖状态下活化的M1巨噬细胞通过释放TNF-α促炎因子,进而激活足细胞ROS-p38MAPK信号通路诱导足细胞凋亡。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

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本文编号：2768629