hucMSC外泌体对草酸及草酸钙诱导HK-2细胞损伤的保护作用及其机制

发布时间：2020-07-25 07:47

【摘要】：目的:探讨人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell exosome,hucMSC-Ex)是否能缓解草酸和一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate,COM)晶体诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)氧化应激及纤维化及其机制。方法:(1)采用草酸和COM晶体诱导体外培养的HK-2细胞。(2)采用无外泌体胎牛血清培养基常规培养人脐带间充质干细胞,差速离心法提取其外泌体。Western blot检测其表面标志蛋TSG101,CD63,Alix表达,透射电镜检测其形态,NTA检测hucMSC-Ex粒径。PKH-26标记外泌体与细胞共培养,观察其细胞内定位。(3)将HK-2细胞分为4组,对照组;外泌体组;草酸+COM组;草酸+COM+外泌体组。将外泌体加入培养基中6h后加入草酸及COM晶体悬浊液培养液。(4)MTT法于24h、48h和72h检测各组细胞活性,采用相应试剂盒检测细胞LDH、H_2O_2、MDA及ROS水平,免疫荧光检测ZO-1、N-Cadherin、TGF-β蛋白的表达;Western blot检测上皮标志物E-Cadherin,ZO-1,间质标志物N-Cadherin,α-SMA及相关信号通路蛋白TGF-β、Smad2的表达水平。结果:(1)草酸和COM晶体处理48h后,HK-2细胞活性降低,形态发生纤维化改变,细胞形态呈多角形、长梭形,细胞间隙增加,粘附性降低。草酸和COM晶体可降低HK-2细胞上皮细胞标志物E-cadherin、ZO-1表达,同时使HK-2细胞高表达间质标志物N-Cadherin、α-SMA并上调信号通路蛋白TGF-β、Smad2表达(2)WB结果显示提取出的hucMSC-Ex阳性表达TSG101,CD63,Alix;电镜下可观察到其形态呈双层膜,中空,圆形或椭圆形。NTA结果显示其大小分布在50~300nm。PKH26标记后的hucMSC-Ex与细胞共培养6h后进入细胞。(3)MTT结果显示:hucMSC-Ex预处理可显著提高暴露于草酸及COM晶体的HK-2细胞活性。外泌体干预后,HK-2细胞LDH、H_2O_2、MDA及ROS水平较诱导后下降。荧光显微镜下发现hucMSC-Ex可升高草酸和COM晶体干预后细胞上皮标志物ZO-1表达,降低N-Cadherin、TGF-β蛋白表达;光镜下观察发现对照组与外泌体组细胞连接紧密,呈铺路石样,草酸及COM晶体干预后HK-2细胞间隙增加,粘附性降低,呈多角形、长梭形,细胞数明显少于其他组,同一时间点hucMSC-Ex干预后细胞结构异常减少。WB结果发现hucMSC-Ex可升高草酸及COM晶体干预后HK-2细胞上皮标志物ZO-1、E-Cadherin表达,降低间质标志物N-Cadherin、α-SMA蛋白表达,TGF-β、Smad2蛋白表达趋势与N-Cadherin、α-SMA相同。结论:(1)超速离心法可成功提取到hucMSC外泌体(2)草酸及COM晶体可诱导HK-2细胞发生氧化应激损伤和上皮间质转化(3)hucMSC-Ex能提高草酸及COM晶体诱导的HK-2细胞活性,减轻其氧化应激损伤,同时缓解其上皮间质转化。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R691.4
【图文】：

示意图,分离流程,示意图,铜网

图 1 hucMSC-Ex 分离流程示意图Fig1 The schematic of the hucMSC-Ex isolation protocol观察 hucMSC-Ex 形态体悬液 10μl，20 倍体积 1x PBS 稀释，吹打混匀；0μl 滴加于 2nm 电镜铜网状栅中；夜干燥，醋酸双氧铀负染 30s，吸走铜网周边多余液体镜 80kV 拍照并保存图像。lot 检测 hucMSC-Ex 蛋白标志物μl 外泌体悬液加入 PMSF 1μl 及 100μl 蛋白裂解液 RIPA液在 4℃超声裂解 15min, 12,000 g 离心 10 min , 取上清明书，用 BCA 法测定蛋白浓度，；

形态图,形态,电位仪,马尔文

显影后保存图像。TA 鉴定 hucMSC-Ex 粒径大小及分布取用 PBS 重悬的外泌体悬液 0.1ml；在 4℃条件下用 PBS 稀释 10 倍后加入比色皿中；放入马尔文 Zs90 粒度电位仪样品池中测量其粒径大小。果ucMSCs 镜下形态用 10% exo-free FBS DMEM/F12 培养的 hucMSC, 贴壁后镜下形态良好,呈较均一的长梭形, 类似成纤维细胞, 呈漩涡状生长, 胞浆丰富, 细胞核 2）。

形态图,透射电镜,形态,学位论文

重庆医科大学硕士研究生学位论文取的 hucMSC-Ex 悬液用 20 倍体积 1×PBS 稀释后, 于透射电镜下可分布圆形或椭圆形的膜性小囊泡, 具有较明显异质性, 直径介于 3外周可见其膜性结构, 内含低密度物质（图 3）。

【参考文献】