长链非编码RNA-linc00346在膀胱癌中的表达及其功能和机制的研究

发布时间：2020-07-27 14:46

【摘要】：研究背景长链非编码RNA(LncRNA)是指序列长度大于200个核苷酸、但无编码蛋白功能的一类RNA。LncRNA在多种恶性肿瘤中存在异常表达,并参与了对肿瘤发生发展的调控作用。目前关于膀胱癌中LncRNA的研究尚不多,其可能的作用机制仍不清楚。目的了解膀胱癌中LncRNA的表达情况,探索LncRNA-linc00346对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并揭示其可能的作用机制。方法1.在6对膀胱癌及癌旁正常膀胱组织标本中进行基因芯片检测,观察LncRNA的差异表达情况,采用qRT-PCR验证基因芯片结果,并进行基因功能和信号通路等生物信息学分析,构建差异基因共表达网络。2.根据生物信息学分析结果,选出linc00346作为目标LncRNA进行深入研究。通过qRT-PCR在52例临床膀胱癌组织标本和膀胱癌T24、SW780细胞系中再次验证linc00346的差异表达情况。3.应用慢病毒载体介导的shRNA技术沉默linc00346在膀胱癌T24和SW780细胞系中的表达,然后进行一系列细胞功能试验,通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等来研究沉默linc00346表达对膀胱癌细胞系生物学行为的影响。4.通过Western blot检测沉默linc00346后T24和SW780细胞系中PI3K/Akt通路PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达变化情况,并加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002进行进一步验证,初步探索linc00346影响膀胱癌细胞的机制。结果1.经过基因芯片筛选,得到了差异表达LncRNA共2548条(FC值2.0),其中在膀胱癌中表达上调的1539条,下调的1009条;明显表达差异(FC值10)的LncRNA上调的有126条,下调的有103条。生物信息学分析显示LncRNAs和rmRNAs之间存在着密切的共表达关系,并选出了在膀胱癌中显著表达上调的linc00346进行功能及机制研究。2.linc00346在膀胱癌组织中表达水平较其癌旁正常组织明显上调,膀胱癌T24和SW780细胞系中linc00346的表达量均显著高于对照的正常人膀胱上皮HUM-CELL-0046细胞系。3.CCK-8、克隆形成实验、Ki67免疫组化、裸鼠移植瘤实验结果显示沉默linc00346可以抑制膀胱癌细胞的增殖能力;流式细胞术、Western blot检测发现沉默linc00346可以影响膀胱癌细胞周期,使肿瘤细胞停滞于G0/GI期,并加剧肿瘤细胞的凋亡;Transwell侵袭实验结果提示沉默linc00346能够削弱膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力。4.沉默linc00346能够显著降低PI3K、Akt的磷酸化水平,即减弱了PI3K/Akt通路的激活。联合应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002时,其对PI3K、Akt磷酸化的抑制作用更加显著。结论1.膀胱癌组织中存在大量差异表达的LncRNAs,这些异常表达的LncRNAs可能与膀胱癌的发生和进展有关。2.linc00346在膀胱癌中表达显著上调,并且能够促进膀胱癌细胞增殖、减少细胞凋亡、增加癌细胞侵袭性和肿瘤转移等生物学行为。3.linc00346可能是通过激活PI3DK/Akt通路磷酸化来对膀胱癌细胞产生影响的。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.14
【图文】：

针信号进行统一标准化处理，目的是使芯片的基础荧光信号强度达成同步一致，逡逑从而避免了因基础荧光信号存在差别而导致实验结果出现误差或差错的情况发逡逑生。１２个样本经过标准化和对数转换后绘制成箱线图，如图１－２所示，１２个样逡逑本的芯片荧光信号强度一致，提高了实验数据对比的可信度。逡逑Ｉ１０＇逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦Ｍ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦！逦ｉ逡逑１逡逑—逦灥W逦■逡逑－－逡逑Ｉ逦１逦Ｉ逦１逦Ｉ逦１逦１逦Ｉ逦Ｉ逦１逦？逡逑Ｉ逦１逦ｔ逦１逦瞻逦《逦？逦．逦Ｊ逦１逦Ｉ逡逑NNN逦NNN逦NNN逦NNN逡逑ｉｌｉｇｌｔｓｓｓｉｓ邋ｓ逡逑Ｓａｍｐｌｅ逡逑图１－２芯片箱线图逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｂｏｘ－ａｎｄ－ｗｈｉｓｋｅｒ邋ｐｌｏｔ邋ｆｏｒ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ逡逑然后检测各样本中ＬｎｃＲＮＡ表达谱的差异性（图１－３）；将筛选得到的差异逡逑表达基因，通过聚类热图、散点图及火山图等直观的图形进行展示。逡逑１９逡逑

图１－３各样本中ＬｎｃＲＮＡ表达谱差异逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋ＬｎｃＲＮＡ邋Ｃｈｉｐ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑①差异基因聚类热图（图１－４）逡逑聚类热图是对样本和基因各自分别进行分级聚类之后，通过热图的形式来逡逑表现基因在不同样本中的表达情况。横坐标是样本名称，样本按照计算所得到逡逑的距离远近值来进行排序；纵坐标是探针号或基因名称。因而聚类分析图表示逡逑各组织样本中ＬｎｃＲＮＡ的表达量差异越大，则它们所处的位置的间距就越远。逡逑２０逡逑

图１－５各样本ＬｎｃＲＮＡ表达散点图逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｓｃａｔｔｅｒ－ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ＬｎｃＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑③火山图（图１－６）逡逑从基因芯片结果数据中筛选出显著性差异表达的ＬｎｃＲＮＡ，需设定差异倍数逡逑（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ值）和ｔ－检验得到的Ｐ－ｖａｌｕｅ值这两个条件，火山图可以展不出满逡逑足上述两条件的差异ＬｎｃＲＮＡ数目以及这些ＬｎｃＲＮＡ在同一平面内的分布情况。逡逑在火山图里，横坐标为ｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ），纵坐标为－ｌｏｇｌＯ（Ｐ－ｖａｌｕｅ），基因表达逡逑的上调或下调用正负号表示。逡逑２２逡逑

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本文编号：2771982