Metadherin在肾脏纤维化中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-30 01:29

【摘要】：肾脏纤维化(Renal Fibrosis,RF)是所有慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)发展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的共同途径。RF机制尚未完全清楚,可能与炎症反应、肾小管上皮-间质转分化(Eβithelial Mesenchymal Transition,EMT)及细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)过度沉积有关。EMT主要表现为上皮细胞极性丧失、获得表达α-SMA的表型、肾小管基底膜(tubular basement membrane,TBM)结构破坏、细胞迁徙和浸润性增强,而且还可以分泌多种细胞因子曾参与炎症反应和纤维化过程。在众多致纤维化因子中,TGF-β是最主要的启动EMT的发生发展的生长因子,可以通过激活Smad信号通路调控ECM相关基因的转录。MAPK(P38/ERK/JNK)信号通路可通过促TGF-β1产生和活化、调节TGF-β1/Smad信号通路、不依赖于TGF-β1途径产生促纤维效应。异黏蛋白(Metadherin,Mtdh)是位于8q22染色体上的原癌基因,目前认为它能够和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin、NF-KB、MAPK等多个信号通路相互作用介导肿瘤细胞发生EMT,介导肿瘤转移、侵袭过程。Mtdh/SND1可被TGF-β激活促进乳腺癌转移;Mtdh通过促进恶性胶质瘤细胞自噬,增加恶性胶质瘤细胞对TGF-β诱导EMT的敏感性,提示Mtdh可能与多种信号通路存在相互调节的关系。然而Mtdh在肾脏疾病,尤其是肾脏纤维化中的作用尚未明确。本实验通过建立纤维化模型来揭示Mtdh在肾脏纤维化中的作用及可能机制。(一)Mtdh在肾脏纤维化模型的肾组织表达1.1Mtdh在单侧输尿管梗阻小鼠模型肾脏中的表达目的:探讨Mtdh在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型肾脏中的表达。方法:建立单侧输尿管梗阻模型:SPF级C57小鼠12只(购于南方医科大学动物中心),将小鼠随机分为假手术组(sham)和单侧输尿管梗阻组(UUO),每组6只小鼠。UUO组行左侧输尿管梗阻手术,sham组小鼠左侧输尿管仅游离不结扎。14天后处死小鼠,灌流冲洗后留取左侧肾脏组织标本。采用HE染色和Masson染色观察肾脏组织结构和纤维胶原沉积程度;采用免疫组织化学法检测肾组织纤维化相关蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA的表达及Mtdh的表达;采用 Westen blot 法检测 Fibronectin、E.cadherin、α-SMA 和 Mtdh 的表达。结果:Mtdh免疫组化结果显示,Mtdh主要表达于肾小管和肾小球中,UUO组Mtdh表达增加;Western blot结果显示UUO组Mtdh蛋白表达增加(P0.05);免疫组化和Western blot结果显示UUO组纤维化指标Fibronectin、α-SMA表达增加,上皮细胞标记物E.cadherin则表达下调(P0.05)。1.2Mtdh在糖尿病肾病模型肾组织中的表达目的:探究 Mtdh在糖尿病肾病纤维化模型中的表达方法:构建糖尿病肾病动物模型:20只Leptin受体基因缺陷背景的先天肥胖性2型DM小鼠(db/db)和10只同周龄同窝野生型小鼠(db/rn)对照组(购于南京大学模式动物研究所),分为DN组(db/db小鼠)和正常对照组(db/m小鼠)。饲养至小鼠21周时终止实验,收集血清检测FBG、Scr、BUN;收集肾脏组织,经多聚甲醛固定后制作石蜡切片经免疫组织化学染色检测Mtdh及纤维化指标Fibronectin、E.cadherin、α-SMA 的表达。结果:db/db小鼠的FBG与db/m组相比显著升高(p0.001);db/db小鼠Scr水平明显高于db/m小鼠(p0.001);BUN在db/db小鼠与db/m小鼠之间未有明显差异(p0.05);血脂指标,包括总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG),db/db小鼠均明显高于db/m小鼠(p0.05)。免疫组化结果显示db/db小鼠的Fibronectin、α-SMA的表达增加,而E.cadherin表达减少,表明db/db小鼠已出现糖尿病肾病纤维化病变。Mtdh表达在db/db小鼠中明显增多,以肾间质增多更显著。小结:Mtdh在UUO梗阻肾病纤维化和糖尿病肾病纤维化模型肾组织中表达升高,可能在促进糖尿病肾病纤维化过程中起作用。(二)Mtdh在肾小管上皮细胞EMT中的作用及可能机制目的:探讨Mtdh在TGF-β1诱导EMT模型中的作用及其可能机制。方法:以5ng/m1TGF-β1刺激肾小管上皮细胞(mTEC细胞),设置0、12、24、48h时间点,诱导EMT模型。采用慢病毒转染构建Mtdh稳定过表达细胞株(LV-Mtdh),采用Western blot法检测Mtdh过表达效率和EMT表型蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA及ERK/P38信号通路分子的表达;采用慢病毒转染构建Mtdh稳定下调表达细胞株(sh-Mtdh),加TGF-β1刺激后,采用Western blot法检测Mtdh下调效率和EMT表型蛋白Fibronectin、E.cadherin、α-SMA及ERK/P38信号通路分子的表达。结果:TGF-β1 刺激 mTEC 细胞,使 Fibronectin、α-SMA 表达增加,E.cadherin则表达下调,随刺激时间增加而愈加明显,表明TGF-β诱导EMT模型构建成功。Mtdh的表达随着TGF-β1刺激时间增加而上调(P0.05)。构建Mtdh稳定过表达mTEC细胞株LV-Mtdh,Mtdh蛋白表达比LV-NC组明显增多,表明稳定过表达细胞系构建成功。LV-Mtdh组比LV-NC组的Fibronectin、α-SMA、COLI表达增加,E.cadherin则表达下调(P0.05);LV-Mtdh组ERK和P38磷酸化水平比LV-NC组增加(P0.05)。构建Mtdh稳定下调mTEC细胞株sh-Mtdh,Mtdh蛋白表达比sh-NC组明显减少,表明稳定下调细胞系构建成功。sh-Mtdh组受TGF-β1 诱导后 Fibronectin、α-SMA 比 sh-NC 对照组表达下降(P0.05),E.cadherin则比sh-NC对照组表达升高(P0.05);sh-Mtdh组受TGF-β1诱导后ERK和P38磷酸化水平比sh-NC组降低(P0.05)。小结:Mtdh在TGF-β诱导EMT模型中表达上调,过表达Mtdh可促进ECM蛋白Fibronectin、α-SMA表达,抑制上皮细胞标记蛋白E.cadherin表达,增加P38/ERK磷酸化水平,抑制Mtdh后mTEC对TGF-β1诱导EMT模型敏感性下降,Mtdh可能通过调节P38/ERK信号通路促进EMT过程。结论:Mtdh在细胞EMT模型和UUO模型及db/db模型中均表达增加;Mtdh促进Fibronectin、α-SMA的表达,减少E.cadherin的表达,促进EMT过程;同时提高ERK/P38磷酸化水平,激活ERK/P38信号通路,加重肾脏纤维化病变。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
【图文】：

为进一步确定ＵＵＯ小鼠肾脏纤维化模型是否成功，我们使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑方法和免疫组织化学染色技术检测ＥＭＴ标记物Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ、Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑的表达情况。如图１－２所示，肾脏组织Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ主要表达于肾脏间质逡逑基质，Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ主要表达在肾小管上皮细胞上；ＵＵＯ组Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ逡逑染色阳性面积明显高于ｓｈａｍ组，而Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ则呈现相反趋势。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ法逡逑检测ＵＵＯ组肾脏组织（图１－３Ａ），Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ａ－ＳＭＡ的蛋白水平高于ｓｈａｍ组逡逑（Ｐ＜０．０５），Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ则显著低于ｓｈａｍ组（Ｐ＜０．０１），与免疫组织化学染色结逡逑果一致。逡逑在肾脏纤维化模型成立的条件下，为了检测Ｍｔｄｈ在ＵＵＯ小鼠肾脏中的表逡逑达及定位，本实验使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法和免疫组织化学染色技术进行检测。如逡逑图１－４Ａ所示，ＵＵＯ组肾脏组织Ｍｔｄｈ的蛋白水平明显高于ｓｈａｍ组（图１－４Ｂ，逡逑Ｐ＜０．０５）。从免疫组织化学染色片子来看

图１－３．Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＵＵＯ模型小鼠肾脏组织纤维化相关蛋白的表达逡逑－

２．３ｄｂ／ｄｂ小鼠肾脏组织病理符合ＤＫＤ疾病改变逡逑为观察ＤＫＤ病变，使用ＰＡＳＭ染色观察肾脏组织的系膜基质、ＧＢＭ和ＴＢＭ。逡逑如图１－５所示，从肾脏组织ＰＡＳＭ染色中可看出，ｄｂ／ｄｂ组小鼠肾小球系膜增生逡逑明显，系膜区增宽，部分肾小球硬化。ｄｂ／ｄｂ组符合ＤＫＤ病理改变，肾小球损逡逑伤明显重于ｄｂ／ｍ组。逡逑ｄｂ／ｍ逦ｄｂ／ｄｂ逡逑图１－５．邋ｄｂ／ｄｂ小鼠ＰＡＳＭ染色图（２００Ｘ，红色箭头为系膜区增生）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５．邋ＰＡＳＭ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｄｂ／ｄｂ邋ａｎｄ邋ｄｂ／ｍ邋ｍｉｃｅ（２００－ｆｏｌｄ）逡逑（Ｒｅｄ邋ａｒｒｏｗ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅｓａｎｇｉａｌ邋ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ邋ａｒｅａ）逡逑２５逡逑

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本文编号：2774795