microRNA-145对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞上皮间充质转化的影响
发布时间：2020-07-30 12:27
【摘要】：目的研究micro RNA-145(miR-145)对转化生长因子(TGF)-β1诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮间充质转化(EMT)的影响。方法人工合成miR-145基因序列,构建真核重组质粒p CMVmiR-145。以未处理HK-2细胞为对照组;以TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1组;以p CMV-myc空白质粒转染后经TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1空白质粒组;以p CMV-miR-145质粒转染后经TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1+miR-145组。采用实时荧光定量PCR检测miR-145表达。采用Western blot检测TGF-β/Smad信号传导蛋白TGF-β1、Smad3、Smad2/3、p-Smad2/3,以及EMT生物标记物蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)和I型胶原蛋白(ColⅠ)的表达水平。采用ELISA法检测培养细胞上清液中FN和Col I的含量。结果miR-145表达质粒构建成功,重组质粒有效转染TGF-β1诱导HK-2细胞。与对照组比较,TGF-β1+miR-145组细胞中miR-145表达上调(P0.01);与对照组和TGF-β1+miR-145组比较,TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组细胞中miR-145表达均下降(P0.01)。与TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组比较,TGF-β1+miR-145组细胞内TGF-β1、Smad3、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达量减少(P0.05);α-SMA、FN、ColⅠ蛋白表达亦明显减少(P0.05);TGF-β1+miR-145组培养液上清中FN、ColⅠ含量减少(P0.05)。结论 miR-145参与TGF-β1处理HK-2细胞EMT的调控。miR-145可能通过抑制TGF-β依赖的Smad信号通路活性,从而抑制肾小管EMT。
【图文】：
验独立重复3次。1.8统计学分析采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同分组细胞形态特点光镜（nikoneclipseE400，日本）下显示，对照组细胞间连接紧密，呈鹅卵石样生长。TGF-β1组中细胞间隙明显增加，部分细胞与周围细胞脱离，形态由鹅卵石形转变为梭形。TGF-β1+miR-145组细胞大部分恢复为鹅卵石样，但仍有少部分为梭形，细胞脱离黏附的现象也有所减少。见图1。对照组TGF-β1组TGF-β1空白质粒组TGF-β1+miR-145组图1各组细胞光镜下形态学改变（×200）对照组细胞连接紧密，呈鹅卵石样；TGF-β1组细胞间隙明显增加，部分细胞与周围细胞脱离，呈梭形；TGF-β1空白质粒组细胞呈梭型，间隙增加；TGF-β1+miR-145组细胞多数形态呈鹅卵石样，细胞脱离黏附较少。
泳结果显示1、2、4~10号克隆在250bp与500bp之间有明亮特异的扩增条带（图2）。接种1号阳性转化子，分装200μL送检测序。采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段进行测序，结果证实插入片段与设计序列完全匹配。2.3荧光倒置显微镜检测质粒转染HK-2细胞状态经质粒转染24h后，在荧光倒置显微镜（奥林巴斯IX81，日本）视野下可观察到空白质粒组对照组空白质粒组miR-145组图3质粒转染HK-2细胞的检测（荧光倒置显微镜，×80）对照组无HK-2细胞发出荧光信号；空白质粒组和miR-145组均可见大量HK-2细胞发出绿色荧光信号。图2GR325琼脂糖凝胶电泳图M：Marker；N：阴性对照；1、2、4~10为阳性转化子；3为阴性转化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表达检测实时荧光定量PCR结果显示，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=157.103，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和空白质粒组（0.537±0.016）比较，miR-145组细胞内miR-145表达（0.836±0.052）显著升高（P<0.01）；而对照组与空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激对HK-2细胞miR-145表达的影响实时荧光定量PCR结果显示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=180.225，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145组（0.733±0.064）比较，TGF-β1组（0.312±0.014）和TGF-β1空白质粒组（0.331±0.018）miR-145表达明显下降（P<0.01）。与对照组比较，TGF-β1+miR-145组miR-145表达升高（P<0.01）。TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.6miR-145对HK-2细胞TGF-β/Smad信号蛋白的影响Westernblot印迹结果显示，予
淼?期2017年6月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol.19No.6Jun.2017·715·2.2miR-145表达质粒的构建miR-145基因扩增片段凝胶电泳结果显示1、2、4~10号克隆在250bp与500bp之间有明亮特异的扩增条带（图2）。接种1号阳性转化子，分装200μL送检测序。采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段进行测序，结果证实插入片段与设计序列完全匹配。2.3荧光倒置显微镜检测质粒转染HK-2细胞状态经质粒转染24h后，在荧光倒置显微镜（奥林巴斯IX81，日本）视野下可观察到空白质粒组对照组空白质粒组miR-145组图3质粒转染HK-2细胞的检测（荧光倒置显微镜，×80）对照组无HK-2细胞发出荧光信号；空白质粒组和miR-145组均可见大量HK-2细胞发出绿色荧光信号。图2GR325琼脂糖凝胶电泳图M：Marker；N：阴性对照；1、2、4~10为阳性转化子；3为阴性转化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表达检测实时荧光定量PCR结果显示，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=157.103，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和空白质粒组（0.537±0.016）比较，miR-145组细胞内miR-145表达（0.836±0.052）显著升高（P<0.01）；而对照组与空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激对HK-2细胞miR-145表达的影响实时荧光定量PCR结果显示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=180.225，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145组（0.733±0.064）比较，TGF-β1组（0.312±0.014）和TGF-β1空白质粒组（0.331±0.018）miR-145表达明显下降（P<0.01）。与对照组比较，TGF-β1+miR-145组miR-145表达升高（P<0.01）。TGF-β1组和TG
本文编号：2775540
【图文】：
验独立重复3次。1.8统计学分析采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同分组细胞形态特点光镜（nikoneclipseE400，日本）下显示，对照组细胞间连接紧密，呈鹅卵石样生长。TGF-β1组中细胞间隙明显增加，部分细胞与周围细胞脱离，形态由鹅卵石形转变为梭形。TGF-β1+miR-145组细胞大部分恢复为鹅卵石样，但仍有少部分为梭形，细胞脱离黏附的现象也有所减少。见图1。对照组TGF-β1组TGF-β1空白质粒组TGF-β1+miR-145组图1各组细胞光镜下形态学改变（×200）对照组细胞连接紧密，呈鹅卵石样；TGF-β1组细胞间隙明显增加，部分细胞与周围细胞脱离，呈梭形；TGF-β1空白质粒组细胞呈梭型，间隙增加；TGF-β1+miR-145组细胞多数形态呈鹅卵石样，细胞脱离黏附较少。
泳结果显示1、2、4~10号克隆在250bp与500bp之间有明亮特异的扩增条带（图2）。接种1号阳性转化子，分装200μL送检测序。采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段进行测序，结果证实插入片段与设计序列完全匹配。2.3荧光倒置显微镜检测质粒转染HK-2细胞状态经质粒转染24h后，在荧光倒置显微镜（奥林巴斯IX81，日本）视野下可观察到空白质粒组对照组空白质粒组miR-145组图3质粒转染HK-2细胞的检测（荧光倒置显微镜，×80）对照组无HK-2细胞发出荧光信号；空白质粒组和miR-145组均可见大量HK-2细胞发出绿色荧光信号。图2GR325琼脂糖凝胶电泳图M：Marker；N：阴性对照；1、2、4~10为阳性转化子；3为阴性转化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表达检测实时荧光定量PCR结果显示，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=157.103，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和空白质粒组（0.537±0.016）比较，miR-145组细胞内miR-145表达（0.836±0.052）显著升高（P<0.01）；而对照组与空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激对HK-2细胞miR-145表达的影响实时荧光定量PCR结果显示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=180.225，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145组（0.733±0.064）比较，TGF-β1组（0.312±0.014）和TGF-β1空白质粒组（0.331±0.018）miR-145表达明显下降（P<0.01）。与对照组比较，TGF-β1+miR-145组miR-145表达升高（P<0.01）。TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.6miR-145对HK-2细胞TGF-β/Smad信号蛋白的影响Westernblot印迹结果显示，予
淼?期2017年6月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol.19No.6Jun.2017·715·2.2miR-145表达质粒的构建miR-145基因扩增片段凝胶电泳结果显示1、2、4~10号克隆在250bp与500bp之间有明亮特异的扩增条带（图2）。接种1号阳性转化子，分装200μL送检测序。采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段进行测序，结果证实插入片段与设计序列完全匹配。2.3荧光倒置显微镜检测质粒转染HK-2细胞状态经质粒转染24h后，在荧光倒置显微镜（奥林巴斯IX81，日本）视野下可观察到空白质粒组对照组空白质粒组miR-145组图3质粒转染HK-2细胞的检测（荧光倒置显微镜，×80）对照组无HK-2细胞发出荧光信号；空白质粒组和miR-145组均可见大量HK-2细胞发出绿色荧光信号。图2GR325琼脂糖凝胶电泳图M：Marker；N：阴性对照；1、2、4~10为阳性转化子；3为阴性转化子。500bp400bp250bp12345678910MN2.4miR-145表达检测实时荧光定量PCR结果显示，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=157.103，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和空白质粒组（0.537±0.016）比较，miR-145组细胞内miR-145表达（0.836±0.052）显著升高（P<0.01）；而对照组与空白质粒组比较，miR-145水平差异无统计学意义（P>0.05）。2.5TGF-β1刺激对HK-2细胞miR-145表达的影响实时荧光定量PCR结果显示，予5μg/LTGF-β1刺激24h后，各组细胞内miR-145表达比较差异有统计学意义（F=180.225，P<0.001）。与对照组（0.526±0.024）和TGF-β1+miR-145组（0.733±0.064）比较，TGF-β1组（0.312±0.014）和TGF-β1空白质粒组（0.331±0.018）miR-145表达明显下降（P<0.01）。与对照组比较，TGF-β1+miR-145组miR-145表达升高（P<0.01）。TGF-β1组和TG
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1 莫仁;彭景涛;马坚;张长存;阮渊;刘永超;周立斌;尹冰德;凡杰;;MicroRNA-145在肾癌中的临床意义及其分子机制探讨[J];现代生物医学进展;2014年21期
本文编号：2775540
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