富含半胱氨酸蛋白61对肾纤维化及肾成纤维细胞的作用及机制研究

发布时间：2020-08-07 16:41

【摘要】：目的富含胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,Cyr61)是一种富含半胱氨酸的具备肝素联结活性的分泌蛋白,主要调理细胞外基质生成、细胞增生、分化、凋亡等重要的生物进程。缺血再灌注性急性肾损伤(IR-AKI)所致的肾纤维化中,肾间质成纤维细胞的异样激活发挥重要作用,而已有研究显示Cyr61在肾组织缺血早期高表达。因此,我们检测IR-AKI后肾纤维化及肾成纤维细胞中Cyr61的表达量,并探究Cyr61对肾成纤维细胞的影响及相关机制。方法 (1)制备IR-AKI后肾纤维化的大鼠模型,采用生化检测和组织病理切片Masson染色方法评估大鼠肾功能及纤维化,Western蛋白印迹试验半定量分析Cyr61蛋白表达变化。(2)利用生物信息学分析缺血再灌注肾脏活化的成纤维细胞中Cyr61的表达情况。(3)TGF-β1(梯度浓度0、0.5、1、2、5μg/L)诱导激活正常大鼠肾脏成纤维细胞株(NRK-49F细胞)48 h,CCK8方法检测细胞增殖活性,Western蛋白印迹试验半定量分析Cyr61蛋白水平。(4)质粒转染NRK-49F细胞,分为:空白组、对照组(空载质粒组)、Cyr61~+组/Cyr61~(--)组(过表达Cyr61质粒组/低表达Cyr61质粒组)。NRK-49F细胞被过表达Cyr61质粒转染24h、48h、72h后,采用CCK8试验测定细胞增生能力。(5)5μg/L TGF-β1刺激及质粒转染细胞48h,将细胞分为:对照组、活化组、Cyr61~+组/Cyr61~(--)组、Cyr61~+活化组/Cyr61~(--)活化组。通过CCK8试验测定细胞增殖活性,通过流式细胞检测法分类细胞周期,通过PCR试验分析Cyr61、纤维化相关因子(胶原蛋白Col1α1与Col3α1、基质金属蛋白酶MMP9与MMP13)以及衰老信号途径(p53/p21途径与p16/Rb1途径)相关因子的基因转录情况,通过Western蛋白印迹试验半定量分析Cyr61、Col3、MMP9蛋白的变化。结果 (1)在IR-AKI后肾脏纤维化过程中,胶原纤维在AKI后1W肾脏中表达最明显,而Cyr61蛋白此时处于最低水平(P0.05);(2)生物信息学基因芯片数据分析显示Cyr61在缺血再灌注后3天肾成纤维细胞中表达降低(P0.05)。(3)与对照组相比,TGF-β1梯度浓度活化的NRK-49F细胞的增殖活性均增加,而Cyr61蛋白水平于1μg/L组降低,5μg/L组升高(P0.05);(4)对比对照组,过表达Cyr61质粒转染24h、48h、72h后细胞的增殖能力均降低,且呈时间依赖性;(5)Cyr61能降低NRK-49F细胞胶原纤维Col1α1 mRNA、Col3α1 mRNA的转录,降低Col3蛋白的水平,同时Cyr61能增加基质金属蛋白酶MMP9 mRNA、MMP13 mRNA的转录,提高MMP9蛋白的表达水平;(6)Cyr61可以抑制NRK-49F细胞的增生能力,促进细胞留滞于G1期,促进细胞衰老途径相关因子p53、p21和Rb的转录。结论 Cyr61不仅可以抑制体外实验中成纤维细胞的纤维化细胞表型,还可能通过p53/p21/Rb相关的细胞衰老信号途径,促进肾成纤维细胞留滞于G1细胞周期、抑制细胞增生能力,进而影响IR-AKI后肾纤维化的过程。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692
【图文】：

肾成纤维细胞,缺血再灌注,箱线图,样本

结果2 生物信息学分析显示 Cyr61 在 IR 后 3 天激活的肾成纤维细胞中低达。从 GEO 数据库 GP1261 基因芯片平台获得 GSE62732 芯片 8 个样本，其中正常肾成纤维细胞 3 个样本和缺血再灌注 45min 所致急性肾损伤后 3 天的肾成细胞 5 个样本。RNA 降解曲线和 NUSE 箱线图评估显示 GSM1532545 样本芯合格（图 2A 和 2B）。排除后的数据分析显示，Cyr61 在 IR 后 3 天激活的肾成细胞中的基因转录显著下降，差别具备统计学意义（P<0.05，图 2C 和 2D）。结果提示 Cyr61 可能与激活的肾成纤维细胞存在一定的相关性。A. B.RNA 降解曲线NUSE 箱线图

细胞的,肾成纤维细胞,活化状态,抑制细胞

5μg/L TGF-β1 均明显增加 Cyr61 蛋白的表达量（P<0.01）。TGF-β1 诱导下 NRK-49F 细胞的增殖活性与 Cyr61 蛋白表达的这种相反趋势（图3D），提示 Cyr61 可能在某种程度上抑制细胞增生活性。本研究也观察到细胞高表达的 Cyr61 蛋白（5μg/L TGF-β1 组）并不足够降低 NRK-49F 细胞的增生能力、不能逆转细胞的活化状态，这可能是细胞自身 Cyr61 蛋白的表达量受限所造成的。后续我们通过质粒转染方法制备呈现 Cyr61 不同水平的肾成纤维细胞，以求进一步探索 Cyr61 的作用及机制。A1B注：对比 0μg/L TGF-β1 组，*p<0.05，***p<0.001；对比 1μg/L TGF-β1 组，#p<0.05，##p<0.01TGF-β1 的浓度（μg/L）

过表达,转染,细胞增殖,细胞的

青岛大学硕士学位论文4 过表达 Cyr61 以时间依赖性方式抑制 NRK-49F 细胞的增生能力。NRK-49F 细胞分为空白组、对照组（空载质粒组）、Cyr61+组（过表达 Cyr61质粒组）。 PCR 分析显示，与空白组及对照组比较，Cyr61+组细胞 Cyr61 mRNA显著高表达（p<0.001，图 4A），达 4000 倍左右，而空白组与对照组对比无统计学意义。Western 半定量分析亦显示，Cyr61+组细胞 Cyr61 蛋白表达较空白组及对照组为高水平（p<0.01，图 4B 和 4C），而空白组与对照组对比无统计学意义。CCK8结果显示，在相同转染时间下，与空白组和对照组对比，Cyr61+组的增殖活性明显受到抑制（均 p <0.01，图 4D），而空白组及对照质粒组的细胞增殖变化均无统计学意义。与 Cyr61+质粒转染 24h 相比，转染 48h 时细胞增生能力受到显著抑制，转染 72h 对细胞损伤更为严重，细胞活性大约仅为同时间段对照组的 25%（均 p<0.05，图 4D）。后续实验中我们选用 48h 作为最佳转染时间点。A. B.

【相似文献】