Corin在糖尿病肾病中的作用研究

发布时间：2020-08-09 02:06

【摘要】：目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是危害人类健康的主要疾病,近年来,其发病率呈现不断上升趋势。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的微血管并发症之一,并且严重影响糖尿病患者的生活质量。Corin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,主要特异性表达于心脏,但在肾脏、子宫、胎盘、骨等多组织系统也有Corin的表达。Corin能切割心房钠尿肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP),并将其活化为心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),产生的ANP具有生物学活性。有研究表明,Corin可参与多种肾脏疾病的发生。在慢性肾病患者中,尿Corin水平与肾脏Corin表达水平均明显下降;在伴有蛋白尿的肾脏疾病中,Corin水平下降可引起水钠潴留。在肾病综合征大鼠动物模型及Corin基因敲除小鼠中均可见Corin水平下降可引起水钠潴留。但是,Corin在糖尿病肾病发病中的作用尚未阐明。因此,本文旨在通过高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株,采用si RNA技术、Real-time PCR、RT-PCR、Western blot以及免疫荧光等相关细胞与分子生物学技术,探讨Corin在糖尿病肾病中的作用,以期阐明糖尿病肾病发病的新的分子机制并发现防治新靶点。方法1.RT-PCR检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP m RNA水平的表达,并以高渗透压组(OC)及正常浓度糖对照组(Ctrl)为对照。2.Western blot检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP蛋白的表达,并以OC组及Ctrl组为对照。3.免疫荧光染色方法检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin表达水平,并以OC组及Ctrl组为对照。。4.构建Corin-si RNA HK-2细胞,RT-PCR鉴定Corin-si RNA的HK-2细胞Corin基因干扰效率。5.Western blot进一步验证Corin-si RNA的HK-2细胞Corin基因干扰效率。6.普通光学显微镜下观察Corin-si RNA HK-2细胞的增殖情况。7.MTT比色法与台盼蓝染色方法检测Corin-si RNA HK-2细胞的增殖情况与活力。8.内皮细胞划痕实验检测Corin-si RNA HK-2细胞上清液对EA.hy926内皮细胞损伤修复的影响。结果1.高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin及ANP m RNA表达水平与Ctrl、OC组相比均降低。2.高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP蛋白表达水平与Ctrl、OC组相比均降低。3.免疫荧光染色(IF)结果表明,与Ctrl、OC组相比,高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin表达水平显著下降(P0.05)。4.导入HK-2细胞中的Corin-si RNA序列1和序列2对Corin基因的干扰效率分别为45.45%、44.18%(P0.01)。5.与NC-si RNA组相比较,导入Corin-si RNA序列1和序列2的HK-2细胞Corin蛋白水平表达均明显下降。6.与NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞的增殖均明显被抑制。7.与NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞增殖能力明显下降(P0.01),Corin-si RNA HK-2细胞活力亦明显降低(P0.01)。8.与Ctrl和NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞培养上清使EA.hy926内皮细胞受损后修复能力受损。结论1.成功构建了Corin缺失的HK-2细胞模型;2.Corin和ANP对肾脏具有保护性作用;3.HK-2细胞Corin缺陷影响EA.hy926内皮细胞损伤后的修复功能;4.Corin缺失参与了糖尿病肾病的内皮功能紊乱的发生;5.在糖尿病肾病中Corin介导的pro-ANP活化途径十分重要。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

结构图,丝氨酸蛋白酶,家族,Ⅱ型

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族结构图。Zhang Y, Li H, Zts, 2014, 4: 7378.白结构域模式图。蛋白酶催化区（Protease）包括组和丝氨酸（S）的残基，按顺序排列；清道夫受体样低密度脂蛋白受体重复序列（LDLR）；富含半胱氨跨膜区（TM）。Wu Q, Xu-Cai YO, Chen S, et09, 75(2): 142-146.疾病中的研究现状物学功能是活化 pro-ANP 生成活性的 ANP【75】。Cor达，研究表明在心脏、肾脏、子宫、胎盘、骨等多

模式图,蛋白结构,模式图

图 2：Corin 的蛋白结构域模式图。蛋白酶催化区（Protease）包括组氨酸（H）、天冬氨酸（D）和丝氨酸（S）的残基，按顺序排列；清道夫受体样半胱氨酸富集区域（SR）；低密度脂蛋白受体重复序列（LDLR）；富含半胱氨酸的卷曲状区域（Fz）；跨膜区（TM）。Wu Q, Xu-Cai YO, Chen S, et al. KidneyInternational, 2009, 75(2): 142-146.3.2 Corin 在临床疾病中的研究现状Corin 的生物学功能是活化 pro-ANP 生成活性的 ANP【75】。Corin 在多种组织器官中都有表达，研究表明在心脏、肾脏、子宫、胎盘、骨等多系统均发现有 Corin 的表达【76】。Corin 敲除小鼠动物模型与野生型小鼠相比较，pro-ANP 水平更高，但检测不到成熟活性的 ANP，当注入活性重组可溶性 Corin 后可以瞬间恢复对 pro-ANP 的加工，并且 Corin 敲除小鼠动物模型更容易发生水钠潴留以及晚期妊娠蛋白尿等疾病，说明 Corin 介导的 pro-ANP 活化途径在维持水钠平衡和肾脏功能中发挥重要作用【84, 85】。Corin 介导 pro-ANP 活化的通路，对维持正常肾脏功能必不可少（如图 3a 所示），当 Corin 介导 pro-ANP 的活化下降时，

示意图,肾病综合征,肾脏,功能

则会通过一系列信号通路导致肾脏水钠潴留，引起肾病综合征（如图 3b 所示）；在正常肾脏中，产生于肾脏的 Corin，将 pro-ANP 转化为具有活性的 ANP，ANP与其受体 NPR-A 结合后可活化鸟苷酸环化酶（GC-A），GC-A 可催化并水解GTP 形成 cGMP，cGMP 的功能为：促进肾小球入球血管舒张和出球血管收缩来增加肾小球滤过、促进水通道蛋白 2（AQP2）从顶膜的释放、抑制上皮钠通道ENaC 的活性、活化 cGMP-依赖性蛋白激酶 2（PKGⅡ）进而降低肾素的释放、结合并活化磷酸二酯酶 5（PDE5）进而反馈抑制 cGMP，综上所述，Corin 在正常肾脏中发挥利钠和利尿的作用；在肾病综合征中，肾脏 Corin 表达下降，导致将 pro-ANP 活化为 ANP 减少，降低的 ANP 进而引起 cGMP 产生减少，进一步导致肾小球滤过率下降、AQP2 升高、ENaC 升高、PKG 升高、PDE5 以及磷酸化 PDE5（pPDE5）升高，最终引起水钠潴留【59】。因此，Corin 参与了肾脏疾病发病以及进展，Corin 可能作为肾脏疾病的生物标志物。

【参考文献】