NOP16通过核糖体应激影响前列腺肿瘤进展机制

发布时间：2020-08-10 11:56

【摘要】：目的:检测在前列腺癌中NOP16的表达水平,下调前列腺癌细胞内的NOP16水平后对前列腺癌细胞形态、总蛋白浓度以及体外生物学行为的影响;下调与NOP16体内结合的蛋白复合体后对NOP16功能的影响;进一步探讨降低前列腺癌细胞中NOP16水平后对核糖体生物合成的影响并初步探讨机制。方法:首先检测NOP16分别在前列腺增生组织以及前列腺癌组织中以及细胞中表达水平是否存在差异,接着运用特异性siRNA敲低NOP16细胞内源性水平,并运用Western Blot、RT-qPCR验证是否敲低成功;运用细胞计数、CCK-8实验检测降低前列腺癌PC3细胞中NOP16水平是否会对影响细胞增殖,运用细胞划痕实验检测降低前列腺癌细胞中的NOP16水平表达是否会对细胞体外迁移产生影响,运用Transwell实验检测降低前列腺癌细胞中的NOP16水平表达是否会对细胞体外侵袭产生影响。运用数据库检索、质谱分析和免疫共沉淀寻找与NOP16相互结合的蛋白并使用RT-qPCR及Western-Blot方法验证,运用特异性siRNA对前列腺癌PC3细胞系内NOP16及相结合蛋白基因分别和共同敲低,对比各组细胞体外行为学差异,最后运用RT-qPCR检测各组细胞内18S和28SrRNA的差异。结果:前列腺癌组织中NOP16明显高于前列腺增生组织;利用NOP16 siRNA对PC3细胞进行转染降低细胞内源性NOP16的表达后,前列腺癌细胞体积变小,细胞总蛋白浓度降低,前列腺癌的细胞体外增殖、侵袭及迁移均得到抑制;联合数据库检索、质谱分析和免疫共沉淀实验筛选出可以在细胞内和NOP16相结合的蛋白hnRNPM,降低hnRNPM蛋白表达后,可以促进前列腺癌PC3细胞的体外侵袭和迁移,但不影响其增殖。运用特异性SiRNA对前列腺癌PC3细胞系内NOP16进行敲低后,细胞内18S和28SrRNA明显减少。结论:前列腺癌细胞内NOP16低表达可使前列腺癌细胞体积大小、总蛋白浓度发生变化,同时前列腺癌细胞的体外生物学行为增殖、迁移、侵袭均会发生改变,并且细胞内核糖体大小亚基同时随NOP16的变化发生变化;异常表达和NOP16在前列腺癌细胞内相结合的蛋白hnRNPM后,前列腺癌细胞的体外迁移和侵袭发生改变,但其增殖变化却不明显。因此我们认为,NOP16的表达可影响前列腺癌的发生发展,且能与hnRNPM互相结合,敲低NOP16后可影响hnRNPM在前列腺癌中的作用,而且其是通过核糖体的应激影响前列腺癌的发生进展。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25
【图文】：

前列腺增生,表达差异

别从临床上收集到的人前列腺增生组织和前列腺癌组织进行RNA提取和反转录及RT -qPCR实验。实验结果显示，NOP16在前列腺癌组织中高表达于前列腺增生组织（详见图1）。图 1 前列腺增生和 PCa 组织中 NOP16 的 mRNA 的表达差异2.2 NOP16在细胞水平时前列腺癌高于正常前列腺上皮除组织之间的对比，另外我们也通过细胞水平比较了人的正常前列腺上皮细胞系RWPE-1和人前列腺癌细胞系PC3中的NOP16的表达量。我们分别从上述两种细胞系中提取总蛋白和RNA，并对提取的蛋白进行Western-Blot实验检测，提取的RNA反转录成cDNA后进行RT-qPCR实验检测。实验结果显示，和正常的人正常前列腺上皮细胞相比，NOP16的蛋白表达水平和mRNA水平在PC3细胞系中高表达（如图2所示）。

细胞系,前列腺上皮细胞,实验检测,反转录

提取的RNA反转录成cDNA后进行RT-qPCR实验检测。实验结果显示，和正常的人正常前列腺上皮细胞相比，NOP16的蛋白表达水平和mRNA水平在PC3细胞系中高表达（如图2所示）。

细胞,统计学意义,同步培养,蛋白

我们分别将特异性NOP16敲低的siRNA转染进PC3细胞中，比较siRNA组、对照组Control组的内源性NOP16的表达水平，结果显示siRNA组的NOP16在蛋白和mRNA水平的表达量显著降低（如图3所示）。收集同步培养的细胞（siRNA组和Control组），且使用细胞计数器收集相同数目的细胞后对两组细胞进行蛋白浓度测定，了解两组细胞处理后各组的蛋白总浓度的差异。结果显示，经过NOP16siRNA敲低后的细胞组的总蛋白浓度表达量明显低于对照组的总蛋白浓度表达量，并且经过分析后显示两组差异具有统计学意义。（n=3，p＜0.05）值得一提的是，在光学显微镜下观察发现，在siRNA处理组的细胞体积相对于对照的Control组变小，具有统计学意义（n=80,p<0.05）（如图4所示）。图 3 构建 NOP16 敲低前列腺癌 PC3 细胞

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