【摘要】：目的急性缺血性肾小球内皮细胞受损机制尚不清楚。本研究拟探讨缺血缺氧/低氧导致Syndecan-1表达减少在肾小球内皮细胞损伤中的作用及机制。方法我们首先通过免疫组化和Western blot检测缺血缺氧或低氧状态下肾小球内皮细胞Syndecan-1表达水平变化;其次,通过siRNA技术敲低肾小球内皮细胞Syndecan-1表达(分别予以Cocl_2、VEGF、Dynasore、MDC、Nystatin或aPKC抑制剂干预),利用流式细胞仪、Western blot、CCK-8及细胞通透性实验分别检测细胞凋亡、活力和细胞通透性变化;Western blot检测VEGF-VEGFR-2通路靶基因、总VEGFR-2、胞膜VEGFR-2、Dab2、p-Dab2、PAR-3、aPKC及p-aPKC表达水平变化;Real-time RT-PCR检测VEGFR-2、Dab2及PAR-3在mRNA表达水平变化;免疫共沉淀检测VEGFR-2与小窝蛋白相互作用情况;细胞免疫荧光和免疫共沉淀检测Syndecan-1与VEGR-2之间是否存在共定位及相互作用;最后,利用siRNA分别敲低肾小球内皮细胞Dab2或PAR-3的表达(予以VEGF干预),流式细胞仪及CCK-8分别检测细胞凋亡及活力变化情况;Western blot检测VEGF-VEGFR-2通路靶基因、胞膜VEGFR-2及总VEGFR-2表达水平变化等。结果(1)缺血缺氧/低氧刺激可导致肾小球内皮细胞Syndecan-1表达下调;(2)Syndecan-1表达下调可通过阻断VEGF-VEGFR-2通路靶基因的表达导致肾小球内皮细胞结构与功能受损;(3)Dynasore及MDC可阻断肾小球内皮细胞VEGF-VEGFR-2通路的激活;Nystatin则可激活VEGF-VEGFR-2通路靶基因的表达;(4)siRNA敲低肾小球内皮细胞Syndecan-1的表达可导致VEGFR-2与小窝蛋白相互作用显著增多;(5)Syndecan-1与VEGFR-2存在共定位及相互作用;(6)Dab2或PAR-3表达下调可通过阻断VEGF-VEGFR-2通路靶基因表达导致肾小球内皮细胞活力下降及凋亡增加;(7)肾小球内皮细胞Syndecan-1表达水平下调可诱导aPKC介导的Dab2磷酸化增加;与Syndecan-1 siRNA转染组相比,aPKC抑制剂干预组肾小球内皮细胞VEGF-VEGFR-2通路靶基因的表达明显增加。结论缺血缺氧/低氧可降低肾小球内皮细胞Syndecan-1的表达;Syndecan-1表达下调通过阻断VEGF-VEGFR-2通路的表达导致肾小球内皮细胞结构与功能受损;Syndecan-1可通过诱导aPKC介导的Dab2磷酸化干预VEGFR-2参与的内吞作用,从而调控VEGF-VEGFR-2通路的表达。该研究为肾小球内皮细胞损伤修复的治疗提供了新靶点,具有重要的临床价值与实践意义。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692
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