Bruton酪氨酸激酶通过调控NLRP3在糖尿病肾病炎症中作用与机制

发布时间：2020-08-11 20:28

【摘要】：背景和目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是终末期肾功能衰竭(endstage renal failure,ESRF)的主要病因之一。近年来众多证据表明,巨噬细胞在肾脏内浸润和激活,引发炎症因子释放,加速了DN的发展。Bruton酪氨酸激酶,属于非受体类酪氨酸激酶,是Tec家族成员之一。主要在髓系细胞表达,例如B淋巴细胞、噬碱性粒细胞、单核细胞等。既往研究证实Btk参与了细胞分裂、增殖及调亡调控,在肿瘤、缺血-再灌注损伤及类风湿关节炎等疾病的发生中起到了重要的作用。我们前期实验发现高糖培养的巨噬细胞p Btk表达增加,Btk抑制剂可抑制高糖环境下巨噬细胞激活。NLRP3炎症小体属于NLRs家族,定位于细胞质,包括NLRP3、ASC、caspase-1,NLRP3通过PYD结构域募集ASC,进而活化caspase-1前体(45),自身裂解为活化形式的caspase-1(20),其可水解切割IL-1β前体为成熟形式的IL-1β。本研究拟采用体内STZ诱导糖尿病模型,应用Btk基因敲除小鼠等手段旨在明确糖尿病肾病患者中是否存在炎症小体的表达激活,探讨Bruton酪氨酸激酶对糖尿病小鼠肾脏NLRP3的调节作用,寻求新手段来改善糖尿病肾脏炎症。方法选取SPF级C57BL/6J小鼠及健康雄性C57BL/6J全髓系细胞Btk基因敲除小鼠,腹腔注射链脲佐菌素50mg/kg,对照组注射相应体积枸橼酸钠溶液,连续注射5天,一周后检测血糖,血糖≥16.7mmol确定为糖尿病模型。随机分为正常对照组,糖尿病模型组,Btk-/-对照组,Btk-/-糖尿病模型组,每组7只小鼠。血糖升高12周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定血糖、肾重、体重及二者比值和24小时尿白蛋白排泄率。光镜观察肾组织病理变化;免疫组化检测活化的巨噬细胞(CD68+i NOS阳性细胞),NLRP3和IL-1β、TNF-α,MCP-1炎症因子的表达;激光共聚焦检测CD68,i NOS,Btk,NLRP3的共表达;western blot检测肾组织Btk,p Btk,i NOS,NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β、TNF-α,MCP-1蛋白的表达,实时定量PCR检测TNF-α,MCP-1,IL-1βm RNA的表达。免疫共沉淀检测ASC与NLRP3的相互作用。结果1.12周末糖尿病模型组小鼠血糖、肾重体重比值及24小时尿白蛋白排泄率明显高于正常对照组(p0.05),Btk-/-糖尿病模型组小鼠肾重/体重及24小时尿白蛋白排泄率明显低于糖尿病模型组(p0.05)。2.与12周末正常对照组小鼠相比,糖尿病模型组小鼠系膜扩张指数和肾小管间质损伤指数评分明显增加(p0.05),Btk-/-糖尿病模型组的病理改变明显得到改善(p0.05)。3.免疫组化显示12周末糖尿病模型组肾组织i NOS、NLRP3、IL-1β、TNF-α,MCP-1炎症因子表达明显高于正常对照组,而Btk-/-糖尿病模型组小鼠肾组织NLRP3表达明显低于糖尿病模型组(p0.05)。4.激光共聚焦显示糖尿病模型组肾组织CD68、i NOS、Btk、NLRP3共定位表达明显高于正常对照组,而Btk-/-糖尿病模型组小鼠肾组织CD68、i NOS、Btk、NLRP3共定位表达明显低于糖尿病模型组。5.Westernblot显示12周末糖尿病模型组p Btk,i NOS、NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β,TNF-α,MCP-的蛋白相对表达量明显高于正常对照组(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型组较糖尿病模型组明显下降(p0.05)。6.实时定量PCR结果表明糖尿病模型组小鼠肾组织TNF-α,MCP-1,IL-1βm RNA表达明显高正常对照组(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型组明显低于糖尿病模型组(p0.05)。7.免疫共沉淀显示糖尿病模型组小鼠肾组织ASC与NLRP3的结合明显高正常对照组(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型组二者的结合明显低于糖尿病模型组(p0.05)。结论糖尿病小鼠肾组织p-Btk,i NOS、NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β、TNF-α,MCP-1的蛋白表达上调及TNF-α,MCP-1,IL-1β的基因相对表达量增加,Btk基因敲除可以下调NLRP3信号通路及炎症因子的表达,提示Btk可能通过下调NLRP3的炎性反应从而减轻糖尿病肾脏的损害,并且可能的机制是影响了ASC与NLRP3的相互作用
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

Btk-/-小鼠肾脏及骨髓来源巨噬细胞Btk蛋白表达

注：1：Control 2:Diabetic 3:Btk-/- 4:Btk-/- diabetic与 Control 组比较：aP<0.05,与 Btk-/-组比较，bP<0.05,与 Diabetic 组比较，cP<0.05图 3 各组小鼠 12 周肾组织病理形态改变 PAS 染色（×400）Fig 3 Renal histopathological changes of 12 weeks in each group

敲基因模型组肾组织织中活化的巨噬细胞与糖尿病模型组比较有明显的减少，肾小球和肾小管免疫荧光表达较糖尿病模型组减弱，提示Btk基因敲除可以抑制活化的巨噬细胞在肾组织中的浸润表达，从而可以保护肾脏。见图4(scale bar:10um)图 4 激光共聚焦检测 CD68 和 iNOS 共表达Fig 4 Co-expression of CD68 and iNOS in each group by immunofluorescence

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本文编号：2789529