PRL-3在糖尿病肾病足细胞上皮间质转分化中的作用

发布时间：2020-08-14 18:47

【摘要】：背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病累及微血管所引起的主要并发症之一,临床上以进行性增多的蛋白尿和持续的肾功能损伤为重要特点,现已成为终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)最主要的原因之一。足细胞是构成肾小球滤过屏障的关键结构,以足细胞异常为主的肾脏疾病,临床上往往以大量蛋白尿为突出表现。目前研究认为,DN也是一种“足细胞病”,主要表现为足细胞肥大、足突融合、足细胞发生原位上皮-间质转分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)以及足细胞数目的减少。当足细胞发生EMT时,将失去成熟足细胞原有的蛋白标记分子转而表达间充质细胞样表型标志物。研究表明,体内和体外的高血糖环境均可通过Snail诱导足细胞发生EMT,影响足细胞特异性蛋白的表达,扰乱足细胞骨架结构及足突形态,进而造成滤过屏障破坏甚至足细胞凋亡从而DN进展。肝再生磷脂酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)属于非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员,首次被发现在直肠癌细胞中过表达且与直肠癌细胞的侵袭、转移能力相关。肿瘤细胞的形态改变在其侵袭、转移过程中发挥着重要的作用,而参与肿瘤细胞形态改变的重要作用机制之一就是EMT,EMT使细胞间粘附性降低,极性逐渐丧失而转变为间质样状态,从而使细胞更具有侵袭、移动能力。近年来,PRL-3已被证实在多种肿瘤细胞中高度表达,且可通过Snail诱导肿瘤细胞EMT的发生。然而,PRL-3在肾脏组织中的表达是否受高糖环境的影响,其与足细胞EMT的发生是否相关暂无研究。目的探讨PRL-3在肾脏组织中的表达情况、高糖环境对PRL-3表达量的影响以及PRL-3在足细胞EMT中的作用。方法(1)SPF标准条件下饲养db/db及db/m小鼠1-2周,监测体重、血糖、尿点式总蛋白等相关指标,判断糖尿病肾病小鼠是否造模成功。(2)于造模成功后的0周、4周、8周、12周随机取3只小鼠取肾脏组织。以正常小鼠为对照组,免疫组织化学染色法检测糖尿病肾病小鼠肾组织中PRL-3的表达情况;Western blot法再次检测糖尿病肾病小鼠肾组织中PRL-3的表达量。(3)体外培养永生化人肾小球足细胞,分成四组后分别以正常糖浓度(5.6mmol/L葡萄糖)、低浓度葡萄糖(20mmol/L葡萄糖)、高浓度葡萄糖(40mmol/L葡萄糖)、高渗透压(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇)为条件刺激24h。收集细胞提取蛋白,通过Western blot法检测各组中PRL-3及足细胞EMT相关蛋白(Nephrin、Podocin、α-SMA)的表达量。(4)以预混后的Lipofectamine2000+特异性shRNA(3:1)转染液转染永生化人肾小球足细胞,以正常糖浓度组为对照,Western blot法检测空载体转染组、shRNA干扰组中PRL-3的表达量。(5)特异性shRNA沉默PRL-3表达后,分成四组:正常糖浓度组(5.6mmol/L葡萄糖)、高浓度葡萄糖组(40mmol/L葡萄糖)、shRNA+高糖组(shRNA干扰+40mmol/L葡萄糖)、空载体+高糖组(scramble序列+40mmol/L葡萄糖),共同培养24h后,Western blot法检测足细胞EMT相关蛋白(Nephrin、Podocin、α-SMA)的表达量。结果(1)PRL-3主要表达在肾脏组织的肾小球部位,糖尿病肾病小鼠中PRL-3的表达量较正常小鼠显著增加(P0.05),且具有时间依赖性。(2)与正常组相比,低浓度葡萄糖组及高浓度葡萄糖组中PRL-3的表达量显著增高(P0.05),且该效应具有浓度依赖性。高渗组中PRL-3的表达量较正常组无明显改变。(3)与正常组相比,低浓度葡萄糖组及高浓度葡萄糖组中Nephrin、Podocin的表达量降低(P0.05),α-SMA的表达量增高(P0.05),该效应具有浓度依赖性。高渗组中Nephrin、Podocin、α-SMA的表达较正常组均无明显改变。(4)特异性shRNA转染足细胞后,分子水平显示PRL-3的表达量显著减少(P0.05),空载体组中PRL-3的表达量较正常组无明显变化。(5)特异性shRNA干扰PRL-3表达后,shRNA+高糖组中α-SMA的表达量较高糖组显著减少,同时Nephrin、Podocin的表达量增加(P0.05)。而空载体+高糖组中PRL-3、Nephrin、Podocin、α-SMA的表达量与高糖组相比均无明显的改变,排除scramble序列对实验结果的影响。结论PRL-3主要在肾脏组织的肾小球部位表达,高糖环境可通过上调PRL-3的表达从而促进足细胞EMT的发生,抑制PRL-3的表达可减轻足细胞的损伤。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

18 2 糖尿病肾病小鼠肾脏组织中 PRL-3 的表达（Western blot 法注：Control:正常组；DN:糖尿病肾病组。*与对照相比，P<0.0糖条件下人足细胞中 PRL-3 的表达情况stern blot 结果显示，与正常糖浓度组相比，低浓度葡萄糖组及 PRL-3 的表达量显著增高（P<0.05），且该效应具有浓度依中 PRL-3 的表达量较正常糖浓度组无明显改变，排除了高达量的影响。见图 3 。

糖尿病肾病小鼠肾脏组织中PRL-3的表达（免疫组化法）

图 3 高糖条件下永生化人足细胞中 PRL-3 的表达情况: Control: 5.6mmol/L 葡萄糖；Hg20: 20mmol/L 葡萄糖；Hg40: 40mmol/L ；Mannitol: 5.6mmol/L 葡萄糖＋34.4mmol/L 甘露醇。*与对照相比，P<高糖条件下人足细胞中 Nephrin、α-SMA、Podocin 的

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本文编号：2793406