PARP抑制剂对肾癌的作用及药物抵抗机制研究

发布时间：2020-08-22 18:46

【摘要】：目的:肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,由于肾癌对放化疗不敏感,靶向药物治疗的效果存在个体差异性,伴有静脉癌栓的肾癌及远处转移肾癌的治疗方法仍有待进一步的研究。本研究旨在1.通过全基因组二代测序探寻肾癌的基因突变特点,探索新的治疗靶点;2.在测序结果证明肾癌中广泛存在BRCAness现象的基础上,研究PARP抑制剂对肾癌的作用;3.探寻肾癌细胞对PARP抑制剂产生药物抵抗的机制。方法:1.对5例伴有静脉癌栓的肾癌进行全基因组测序,并进行突变签名分析。2.对TCGA数据库中537例肾透明细胞癌的测序数据进行突变签名分析。2.使用MTT增殖实验检测六株肾癌细胞系(786-O,RCC4,Caki-1,Caki-2,A498,ACHN)对PARP抑制剂Talazoparib,Olaparib的敏感性,分别检测肾癌细胞系对PARP抑制剂和化疗药物卡铂、HDAC抑制剂SAHA(vorinostat)、ATM抑制剂KU55933联合用药的敏感性。3.设置BRCA2突变的胰腺癌Capan-1细胞系为对照组,通过westem-blot的方法检测实验组肾癌细胞对53BP1-RIF1轴蛋白表达情况。4.使用免疫荧光的方法检测肾癌细胞对PARP抑制剂联合卡铂作用于肾癌时DNA损伤情况及53BP1-RIF1轴蛋白表达情况。5.通过转入过表达质粒在肾癌细胞中过表达53BP1,观察其对PARP抑制剂的反应。6.使用免疫组化的方法,在500例患者的组织微阵列中研究肾癌患者中53BP1表达情况。分析53BP1表达与临床病理指标和预后指标的关系。结果:1.对5例伴静脉癌栓的肾癌进行全基因组测序,在原发灶及癌栓中均发现高AC3的突变签名及BRCAness现象。对TCGA数据库中537例肾癌标本的测序结果进行分析发现肾癌广泛存在AC3突变签名及BRCAness现象。2.肾癌细胞系对PARP抑制剂存在药物抵抗,并且这种对PARP抑制剂的药物抵抗不能通过与Carboplatin、SAHA、KU55933的联合用药而得到有效改善。3.肾癌细胞系中存在53BP1-RIF1轴失调,53BP1在肾癌细胞系中普遍低表达。4.PARP抑制剂联合卡铂用药,可以诱导肾癌细胞系产生DNA损伤但不能诱导细胞凋亡。5.过表达53BP1可以使肾癌细胞系对PARP抑制剂及卡铂联合用药敏感。6.53BP1在7%左右肾癌患者中表达缺失,在14%左右肾癌患者中低表达,表达缺失和低表达组与高表达组的预后没有显著统计学差异。结论:肾癌中广泛存在AC3突变签名,说明肾癌中广泛存在BRCAness现象。尽管存在BRCAness现象,肾癌细胞系对PARP抑制剂存在抵抗,这种抗性由53BP1的缺失或低表达介导。尽管53BP1表达情况对肾癌患者预后没有显著统计学差异,但有可能成为PARP抑制剂在肾癌中应用的标记物。对于BRCAness现象存在,同时53BP1高表达的肾癌,PARP抑制剂的应用潜力值得进一步探索。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.11
【图文】：

图１．１伴静脉癌栓的肾细胞癌突变签名分析结果逡逑图为按照患者编号１－５的顺序排列的ＲＣＣ伴ＶＴＴ患者的二代测序结果突变签名逡逑（ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）分析。逡逑２．２邋ＴＣＧＡ数据库肾透明细胞癌测序数据突变签名分析结果逡逑基于以上的测序和分析结果，我们决定扩大分析样木量，利用ＴＣＧＡ数据库逡逑的肾癌测序数据进行突变签名分析，以验证以上发现的现象。通过木次试验，我逡逑们发现ＴＣＧＡ肾透明细胞癌样本中，普遍出现频率最高的“突变签名”包括ＡＣ１，逡逑ＡＣ１２，邋ＡＣ２７和ＡＣ３。其中ＡＣ１在各类癌症中广泛出现，ＡＣ２７在部分肾癌病人样逡逑本中出现。而ＡＣ３的频率最高，它与ＤＮＡ双链损伤修复过程密切相关。这一实验逡逑的结果与前期五例癌栓测序结果相一致，再次印证了肾癌中存在的高ＡＣ３突变签逡逑

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孵育会降低检测的灵敏度。７．使用移液管再次混合每个样品并读取５７０ｎｍ处的光度。逡逑２．结果逡逑２．１肾癌细胞系对ＰＡＲＰ抑制剂抵抗。逡逑为了研究ＰＡＲＰ抑制剂对肾癌细胞系的作用效果，我们选取了两个ＰＡＲＰ抑剂，奥拉帕尼（Ｏｌａｐａｒｉｂ）和他拉唑帕尼（Ｔａｌａｚｏｐａｒｉｂ）。对六株肾癌细胞系７８６－０ＲＣＣ４，Ｃａｋｉ－ｌ，邋Ｃａｋｉ－２，Ａ４９８，ＡＣＨＮ用药，分别设置三个时间点检测药物对肾细胞系的作用。实验结果显示，在用药２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ三个时间点，肾癌细胞对于奥拉帕尼，他拉唑帕尼两个药物单独用药表现出抵抗。这两个药物即便在常高的浓度１００ｕＭ时，也无法使肾癌细胞系的增殖活力降到５０％以下，实验结见图图１．１，图１．２，图１．３。逡逑－－

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本文编号：2801017