苯甲酸雌二醇影响小鼠睾丸细胞增殖及糖代谢的初步研究

发布时间：2020-08-22 21:21

【摘要】：目的:建立苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)损伤雄性小鼠动物模型,分析EB对小鼠睾丸细胞增殖及睾丸组织中ATP含量、糖酵解产物、限速酶及单羧酸转运蛋白的变化,探讨EB导致小鼠生精功能损伤的机制。方法:90只健康清洁级雄性昆明小鼠随机分为三组,即对照组(玉米油),5、10 mg/kg EB染毒组。对照组肌肉注射150μl玉米油,实验组按体重分别注射含5 mg/kg、10mg/kg EB的玉米油150μl,隔天1次,持续4周。建模后进行下列实验:第一部分:(1)每组随机选6只雄性小鼠按1:2比例与健康雌性小鼠合笼,记录雌性小鼠受孕数和产仔数以评估父代小鼠生育力。(2)其余各组雄性小鼠全部颈椎脱臼处死,取睾丸、附睾称其重量并计算脏器系数。(3)附睾尾制备精子悬液,显微镜下计数精子数量;制备附睾尾石蜡切片,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察附睾尾组织结构变化。(4)制备睾丸石蜡切片,HE染色观察睾丸组织结构变化,过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色对生精上皮进行分期并计数生精上皮(第VII期)精原细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞数量;制备睾丸组织电镜切片,观察睾丸生精上皮细胞超微结构的变化。(5)流式细胞术检测睾丸细胞周期各时相所占比例。(6)实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PT-PCR)技术检测睾丸组织Cyclin A1、Cyclin B1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Vasa m RNA表达。(7)睾丸组织匀浆,化学比色法检测睾丸组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catelase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量变化;q RT-PCR技术检测睾丸组织SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPx4)m RNA表达。第二部分:(1)高效液相色谱法检测睾丸组织三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量变化。(2)睾丸组织匀浆,化学比色法检测葡萄糖、丙酮酸、乳酸含量和己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。(3)q RT-PCR技术检测睾丸组织单羧酸转运蛋白2(monocarboxylate transporter 2,MCT2)、MCT4 m RNA表达。结果:第一部分:EB染毒组与对照组相比:(1)雌性小鼠与对照组雄性小鼠合笼均成功妊娠、产仔,平均产仔数为11±0.58只;与EB染毒组雄性小鼠合笼的均未妊娠。(2)睾丸、附睾重量和脏器系数显著下降(P0.05);(3)对照组精子悬液显微镜下可见大量精子,而EB染毒组精子悬液显微镜下未见精子;光学显微镜下可见对照组附睾管管腔大而规则,可见大量精子,EB染毒组附睾管管腔未见精子。(4)对照组小鼠睾丸生精上皮细胞排列紧密,生精小管管腔内有大量精子;EB染毒组小鼠睾丸生精上皮细胞排列稀释,生精小管管腔内无精子,生精上皮精原细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞数量显著下降(P0.05);透射电镜观察EB染毒组睾丸精原细胞、初级精母细胞、精子细胞和支持细胞线粒体出现空泡,细胞间出现大量空隙。(5)睾丸细胞G0/G1期和S期细胞所占比例下降(P0.05);G2/M期所占比例显著升高(P0.05)。(6)睾丸组织中Cyclin A1、Cyclin B1、PCNA m RNA表达随EB剂量升高显著下调(P(27)0.05);Vasa m RNA表达10 mg/kg组显著下调(P(27)0.01),5mg/kg组与对照组无显著差异(P0.05)。(7)睾丸组织中SOD、CAT、GSH-Px活力及m RNA表达水平显著降低,NOS活力和NO、MDA含量显著升高(P0.05)。第二部分:EB染毒组与对照组相比,睾丸组织中:(1)ATP含量显著下降(P0.05)。(2)葡萄糖、丙酮酸含量显著升高(P0.05),各组间乳酸的含量无显著差异(P0.05);HK、PK活力显著下降(P0.05),LDH活力各组间无显著差异(P0.05)。(3)MCT2和MCT4 m RNA表达显著下降(P0.05)。结论:第一部分:1.EB通过下调睾丸组织Cyclin A1、Cyclin B1、Vasa和PCNA m RNA表达,阻滞细胞周期,延迟有丝分裂,抑制细胞增殖,引起生精细胞数量减少。2.EB降低睾丸组织抗氧化能力,诱发氧化应激损伤,破坏生精细胞和支持细胞线粒体结构,导致睾丸生精障碍。第二部分:EB通过降低睾丸组织中ATP含量、HK和PK活性及下调MCT4、MCT2 m RNA表达,抑制葡萄糖分解为丙酮酸,降低乳酸转运能力,推测糖代谢紊乱、能量缺乏是EB导致睾丸生精障碍的重要原因。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R698

【参考文献】