Kallikrein-8促进内皮细胞间质转化在糖尿病心脏和肾脏间质纤维化中的作用及其机制研究

发布时间：2020-08-23 22:42

【摘要】：组织激肽释放酶相关肽酶(tissue kallikrein-related peptidases,KLKs)是一类具有胰蛋白酶和糜蛋白酶样活性的丝氨酸蛋白酶家族,KLKs可特异性地裂解低分子量激肽原以形成激肽,后者通过选择性地刺激缓激肽B1和B2受体进而发挥广泛的生物学作用。本课题组前期研究指出KLK8上调诱导心肌肥厚以及进展性心功能障碍,并且这一作用是依赖于EGF及PAR1/2信号通路而并非激肽受体信号通路。与此同时,本课题组同样发现KLK8上调诱导心肌间质纤维化,并且内皮细胞功能紊乱触发的内皮间质转化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)参与KLK8上调介导的心肌间质纤维化的发生。糖尿病是以长期高血糖为主要特征,全身多器官系统病变的代谢紊乱综合征;据统计,2017年全球糖尿病患者人数高达4.35亿;据估计,至2045年,全球糖尿病患者人数将超过6亿,糖尿病正逐渐成为全球性疾病。糖尿病如果不能够及时诊断、治疗将会引发多种并发症,包括糖尿病心肌病、糖尿病肾病等,而后者以器官功能紊乱以及组织纤维化为主要特征。研究指出激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system,KKS)参与糖尿病及其并发症的病理发生发展,然而其中的机制尚未完全阐明,那么是否KLK8参与糖尿病心肌病以及糖尿病肾病器官功能紊乱以及组织纤维化的发生呢?因此,本研究在整体水平上采用1型糖尿病小鼠模型,细胞水平上高糖处理HCAECs以及HRGECs,拟首先观察KLK8在内皮细胞高糖处理时的表达改变,继而利用KLK8转基因和KLK8基因敲除两种模式动物、通过整体和细胞水平的实验证实KLK8在糖尿病心肌以及肾脏组织EndMT和间质纤维化病理发生发展过程中的关键作用,并阐明其分子机制。主要实验结果如下:第一部分KLK8促进内皮间质转化在糖尿病心肌病心肌间质纤维化中的作用及其机制研究一.高糖显著上调糖尿病小鼠心脏及冠脉内皮细胞KLK8表达1.(1)腹腔注射STZ构建1型糖尿病小鼠,构建成功3/6个月后检测心脏KLK8mRNA表达,糖尿病组KLK8表达显著高于对照组,并表现出明显的时间依赖性;(2)人冠状动脉内皮细胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)给与5.5mM、15mM、25mM葡萄糖处理120h,对照组给与mannitol处理;与对照组相比,高糖可显著上调KLK8在mRNA水平表达,并表现出明显的浓度依赖性;二.过表达KLK8诱导人冠状动脉内皮细胞发生EndMT1.HCAECs给与KLK8腺病毒转染72h以过表达KLK8,同空载体组相比,过表达KLK8可显著增加间质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)与波形蛋白(vimentin)蛋白表达,降低内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)和内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)表达,即诱导EndMT;(2)TGF-β1中和抗体部分阻断过表达KLK8诱导的EndMT,即抑制KLK8诱导的αSMA与vimentin表达上调以及CD31与VE-cadherin表达下调;二.KLK8上调参与高糖诱导的内皮细胞功能紊乱、EndMT以及心脏纤维化应用KLK8 siRNA以敲低内皮细胞KLK8表达,对照组给与等量control siRNA;与对照组相比,KLK8 siRNA可显著逆转高糖诱导的内皮细胞功能紊乱,即内皮细胞损伤标志物vWF,sTM以及E-selectin均显著降低,内皮细胞活力显著升高,而单独转染KLK8 siRNA对内皮细胞功能无影响;此外,KLK8 siRNA可显著逆转高糖诱导的VE-cadherin与CD31蛋白表达下调以及αSMA与vimentin蛋白上调;三.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏组织纤维化以及心脏EndMT1.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏内皮功能紊乱以及心脏功能紊乱;(1)小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)以构建1型糖尿病小鼠,模型构建成功后6个月检测血糖水平,同野生型组相比,野生型糖尿病组血糖显著增高,然而KLK8敲除糖尿病组小鼠血糖未见明显降低;(2)同野生型对照组相比,糖尿病小鼠血清vWF,sTM,E-selectin均显著升高,而KLK8缺失组糖尿病小鼠vWF,sTM,E-selectin较野生型组糖尿病小鼠显著降低;2.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏EndMT;与野生型组相比,糖尿病小鼠心脏组织VE-cadherin和CD31表达显著降低,αSMA和vimentin表达显著升高,KLK8缺失可显著逆转高糖诱导的内皮细胞标志物降低以及间质细胞标志物增高,而单独KLK8缺失小鼠心肌组织内皮细胞以及间质细胞标志物未见明显改变,免疫荧光双染结果同样显示,同对照组相比,野生型糖尿病小鼠心脏CD31表达显著降低而αSMA,vimentin与fsp1表达显著增高,并且存在大量CD31与αSMA,vimentin以及fsp1共染,而KLK8缺失可显著增加心脏CD31表达且αSMA,vimentin与fsp1表达显著降低;3.KLK8缺失可显著减轻糖尿病心脏组织纤维化及心脏功能紊乱;(1)同野生型对照组相比,6个月糖尿病小鼠血压升高、心率降低、心脏收缩功能障碍,KLK8缺失可显著逆转高糖诱导的血压升高、心率降低以及心脏收缩功能障碍,而单独KLK8缺失小鼠血压、心率、心功能未见明显异常;(2)Masson染色结果显示,KLK8缺失同样可显著降低糖尿病心脏组织纤维化;四.KLK8降解VE-cadherin,进而促进γ-catenin发生核转位1.KLK8过表达诱导内皮细胞损伤以及EndMT并非通过激肽B1或B2受体,而是通过其酶的活性(1)应用B1R siRNA与B2R siRNA以下调激肽B1和B2受体表达,MTT结果显示,B1R siRNA与B2R siRNA并不能阻断KLK8腺病毒引起的内皮细胞活力降低,不仅如此,B1R siRNA与B2R siRNA同样不能阻断KLK8上调引起的EndMT;(2)应用两种蛋白酶的抑制剂:antipain与硫酸锌以阻断KLK8的蛋白水解作用,同对照组相比,antipain及硫酸锌可部分阻断KLK8诱导的内皮损伤以及EndMT,即增加内皮细胞活力,上调VE-cadherin和CD31蛋白表达,降低αSMA和vimentin蛋白表达;2.KLK8降解VE-cadherin继而引发γ-catenin发生核转位(1)Western blot结合N-末端测序KLK8可剪切VE-cadherin形成一个约30kDa细胞外片段;(2)腺病毒载体处理的内皮细胞γ-catenin位于细胞膜并且部分与VE-cadherin共定位,而KLK8腺病毒处理组细胞膜γ-catenin与VE-cadherin量显著减少,并且细胞核内存在大量γ-catenin表达;不仅如此,同腺病毒载体相比,KLK8导致内皮细胞胞膜及胞浆中γ-catenin表达降低而细胞核内表达量显著升高,而转染VE-cadherin慢病毒可逆转KLK8诱导的γ-catenin核转位以及胞膜和胞浆γ-catenin表达量;五.γ-catenin参与介导KLK8诱导EndMT,而这一作用是通过与p53相互作用完成1.γ-catenin参与介导KLK8诱导EndMT应用γ-catenin siRNA以下调内皮细胞γ-catenin表达,γ-catenin siRNA可显著逆转KLK8诱导的内皮细胞VE-cadherin与CD31表达降低以及αSMA与vimentin的表达升高;2.γ-catenin参与介导KLK8诱导EndMT的作用是通过与p53相互作用完成(1)Co-IP结果显示,γ-catenin在内皮细胞中与p53和TCF4相互联系,且KLK8过表达可进一步加强γ-catenin与p53和TCF4间的结合作用;(2)p53抑制剂pifithrin-α可逆转KLK8诱导的EndMT,然而,TCF/β-catenin通路抑制剂ICG-001不能逆转KLK8介导的EndMT;3.TGF-β1参与介导KLK8诱导的EndMT和心脏组织纤维化(1)KLK8可显著增加内皮细胞TGF-β1在mRNA的表达,这一作用可以被γ-catenin siRNA以及pifithrin-α部分逆转,然而,ICG-001不能逆转KLK8对TGF-β1的mRNA表达;(2)CHIP结果表明HIF-1α可结合到TGF-β1启动子区的缺氧反应元件,而KLK8可进一步增强这一结合作用,HIF-1α的抑制剂echinomycin不仅能够抑制TGF-β1的基础表达,而且能够阻断KLKL8诱导的TGF-β1在内皮细胞mRNA水平的表达,γ-catenin siRNA与pifithrin-α可显著逆转KLK8诱导的HIF-1α与TGF-β1的结合作用;4.p53-Smad3通路参与介导KLK8诱导的EndMT以及心脏组织纤维化(1)KLK8过表达可显著增加内皮细胞p53与Smad3的结合作用,而这一作用可被γ-catenin siRNA部分阻断;(2)KLK8过表达可显著增加内皮细胞TGF-β1/Smad3通路促纤维化靶基因包括Snail,Slug,Twist,Zeb1,Zeb2在mRNA水平的表达,然而γ-catenin siRNA与pifithrin-α可显著逆转KLK8诱导的促纤维化转录因子表达;六、高葡萄糖促进γ-catenin依赖性的p53与HIF-1α和Smad3相互作用,继而以KLK8依赖性的方式增加TGF-β1/Smad3促纤维化靶基因表达1.KLK8参与高葡萄糖诱导的γ-catenin核转位及TGF-β1依赖性促纤维化通路激活(1)高葡萄糖处理导致内皮细胞胞膜及胞浆中γ-catenin表达显著降低,细胞核中γ-catenin表达明显升高,然而KLK8 siRNA可降低细胞核且增加胞膜和胞浆中γ-catenin含量;(2)高葡萄糖处理导致TGF-β1 mRNA表达及释放显著增加,与此同时TGF-β1/Smad3通路促纤维化靶基因mRNA表达同样明显增加,然而KLK8siRNA与γ-catenin siRNA可以很大程度上逆转高葡萄糖所诱导的TGF-β1/Smad3通路促纤维化靶基因表达。2.KLK8参与介导高糖诱导的γ-catenin依赖性p53与Smad3、HIF-1α的相互作用(1)高葡萄糖可导致内皮细胞γ-catenin与p53间联系明显加强,然而KLK8siRNA可显著逆转γ-catenin与p53间相互联系。不仅如此,KLK8 siRNA与γ-catenin siRNA同样能够逆转高葡萄糖诱导的内皮细胞p53与HIF-1α和Smad3间的相互作用。CHIP结果显示:高葡萄糖能够进一步加强HIF-1α与TGF-β1启动子区缺氧反应元件的结合作用,然而KLK8 siRNA,γ-catenin siRNA及p53抑制剂可显著逆转高糖诱导的HIF-1α与TGF-β1启动子的结合作用;(2)在整体水平上,我们发现STZ诱导的1型糖尿病小鼠在24周时心脏TGF-β1 mRNA与蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纤维化靶基因表达均显著增加,而KLK8缺失可显著逆转糖尿病心脏TGF-β1 mRNA与蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纤维化靶基因表达的增加;(3)KLK8缺失可显著逆转糖尿病心脏γ-catenin与p53间相互联系,KLK8缺失同样可以逆转糖尿病心脏p53与HIF-1α和Smad3间的相互作用。整体水平的CHIP结果显示,同野生型组相比,KLK8缺失可显著逆转HIF-1α与TGF-β1启动子区的结合作用。结论:高糖促进心肌组织KLK8表达,进而通过诱导心脏内皮细胞功能紊乱触发的EndMT导致心脏间质纤维化、心脏功能紊乱,而这一作用是依赖于KLK8作用于VE-cadherin-γ-catenin复合体,VE-cadherin被降解,γ-catenin发生核转位,进而激活TGF-β信号通路来完成。第二部分KLK8促进内皮间质转化在糖尿病肾病肾脏间质纤维化中的作用及其机制研究一.转基因KLK8大鼠肾脏组织发生End MT以及纤维化1.KLK8过表达导致肾脏组织纤维化和肾脏损伤Masson染色结果显示:转基因KLK8大鼠肾脏组织较之同龄野生型相比出现明显的胶原堆积,并且表现出明显的时间依赖性,即12周龄转基因KLK8大鼠肾脏组织胶原堆积明显多于6周龄;并且肾脏组织中羟脯氨酸和胶原蛋白及TGF-β1水平较对照组明显升高;尿蛋白检测结果同样显示转基因KLK8大鼠较之同龄野生型相比尿蛋白含量明显增加,并且均表现出明显的时间依赖性;2.KLK8过表达导致肾脏组织发生End MT同野生型大鼠相比,转基因KLK8大鼠肾脏组织vimentin和α-SMA表达显著增加,而VE-cadherin和CD31表达显著降低;进一步免疫荧光双染技术结果表明:较之同龄野生型大鼠相比,12周龄转基因KLK8大鼠肾脏组织内皮细胞标志物CD31表达显著降低,而间质细胞标志物α-SMA、fsp1显著增多,并且存在大量与CD31共染的阳性细胞,共聚焦结果同样证实转基因KLK8大鼠肾脏组织CD31与α-SMA、fsp1存在共定位;3.过表达KLK8导致人肾小球内皮细胞功能紊乱KLK8腺病毒转染人肾小球内皮细胞(Human glomerular endothelial cells,HRGECs)以过表达KLK8,KLK8可导致内皮细胞活力显著下降,并表现出时间和浓度依赖性,不仅如此,内皮损伤的标志物E-selectin,s TM,v WF的释放量明显增加,并且内皮细胞通透性显著增加;4.过表达KLK8诱导HRGECs发生EndMTKLK8可剂量依赖性地增加αSMA与vimentin蛋白表达,降低CD31与VE-cadherin表达;二.KLK8上调参与高糖诱导的内皮细胞功能紊乱、End MT以及肾脏间质纤维化1.KLK8上调参与高糖诱导的内皮细胞功能紊乱应用KLK8 si RNA以敲低内皮细胞KLK8表达,MTT结果表明KLK8 si RNA可显著逆转高糖诱导的内皮细胞功能紊乱,而单独转染KLK8 si RNA对内皮细胞功能无影响;2.KLK8上调参与高糖诱导的End MT同对照组相比,高糖可显著上调αSMA与vimentin蛋白的表达,降低VE-cadherin与CD31蛋白表达,而KLK8 si RNA可降低高糖诱导的αSMA与vimentin上调以及VE-cadherin与CD31下调;三.γ-catenin参与介导KLK8诱导End MT(1)γ-catenin si RNA可显著逆转KLK8诱导的内皮细胞VE-cadherin与CD31表达降低以及αSMA与vimentin的表达升高;此外,γ-catenin si RNA可同样逆转KLK8诱导的内皮细胞活力降低;(2)KLK8可显著增加内皮细胞TGF-β1在m RNA水平的表达,这一作用可以被γ-catenin si RNA部分逆转;(3)CHIP方法证实HIF-1α可结合到TGF-β1启动子区的缺氧反应元件,而KLK8可进一步增强这一结合作用,且HIF1-α抑制剂可逆转KLK8上调内皮细胞TGF-β1在m RNA水平的表达;结论:高糖促进肾脏组织KLK8表达,进而通过诱导心脏内皮细胞功能紊乱、End MT导致肾脏间质纤维化、肾脏功能紊乱,而这一作用是依赖于KLK8激活TGF-β信号通路来完成。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：

STZ组小鼠血糖显著高于对照组（A），而且糖尿病小鼠6个月时心脏出现明显的纤维化（B）。图1. 糖尿病小鼠血糖及心脏组织纤维化的情况。检测小鼠血糖(A)及心脏组织纤维化(B)；** P<0.01 vs Control;Figure1. Blood glucose and cardiac fibrosis in diabetic mice. The blood glucoseconcentration (A) and level of cardiac fibrosis（B）in diabetic mice were measured. Datawere showed as mean±SEM (n=7).** P<0.01 vs WT;（二）糖尿病小鼠心脏出现 EndMT如前所述，EndMT参与糖尿病心脏纤维化的病理发生过程，因此我们检测内皮细胞标志物VE-cadherin与CD31及间质细胞标志物αSMA与Vimentin蛋白表达。如图2所示，糖尿病小鼠心脏VE-cadherin与CD31蛋白表达显著降低，而αSMA与Vimentin蛋白表达显著增高。

图2.糖尿病小鼠心脏VE-cadherin与CD31及αSMA与Vimentin蛋白表达；WB检测心脏VE-cadherin与CD31以及αSMA与Vimentin在蛋白质水平的表达（B）；Figure2. The protein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMA and Vimentin indiabetic mice heart. The protein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMA andVimentin in diabetic mice heart were measured by WB (A).（二）高糖对心脏及内皮细胞 KLK8 表达的影响本课题组前期研究显示：在高血压以及压力超负荷心脏疾病大鼠模型中，心脏KLK8的表达显著升高；那么，高糖是否同样可以上调KLK8表达呢？因此应用高糖处理HCAECs检测内皮细胞KLK8表达，结果表明：同对照组相比，高糖可显著上调心脏(A)及内皮细胞KLK8在mRNA水平(B)的表达，并表现出明显的时间和浓度依赖性。

心脏VE-cadherin与CD31及αSMA与Vimentin蛋白表D31以及αSMA与Vimentin在蛋白质水平的表达（B）otein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMeart. The protein expression of VE-cadherin and CDetic mice heart were measured by WB (A).高糖对心脏及内皮细胞 KLK8 表达的影响期研究显示：在高血压以及压力超负荷心脏疾病大著升高；那么，高糖是否同样可以上调KLK8表达呢？内皮细胞KLK8表达，结果表明：同对照组相比，高胞KLK8在mRNA水平(B)的表达，并表现出明显的时

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本文编号：2802119