FK228在肾脏间质纤维化中的作用研究

发布时间：2020-09-02 09:55

　　第一部分FK228减轻UUO诱导的小鼠肾脏间质纤维化【目的】探讨HDAC的表达与肾脏纤维化之间的关系,以及I类HDAC抑制剂FK228在抑制肾脏纤维化进展中的作用和机制。【方法】使用雄性C57BL/6小鼠建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,并腹腔注射FK228进行干预。实验分为三组:Sham组,UUO组,UUO+FK228组(0.5mg/kg/天,连续给药7天)。在术后第7天,收集小鼠肾脏标本。对肾脏组织进行HE染色和天狼星红染色,来评估其病理变化和纤维化程度。采用免疫组织化学染色检测α-SMA、Collagen I和纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)在间质的表达情况。通过Western blot检测小鼠肾脏中纤维化相关蛋白和乙酰化组蛋白H3的表达。利用实时荧光定量PCR来检测小鼠肾脏中纤维化相关蛋白、炎性细胞因子、HDAC1和HDAC2的m RNA水平。通过F-actin的免疫组织化学染色来检测小鼠肾脏中成纤维细胞的活化情况。【结果】肾脏组织HE染色和天狼星红染色结果显示,与Sham组相比,UUO组的小鼠肾脏发生明显的间质纤维化,肾小管显著扩张,出现蛋白管型,间质中有大量的胶原纤维沉积。肾脏中α-SMA,Collagen I,FN和F-actin的表达水平均出现了升高,同时HDAC1和HDAC2的m RNA水平也都显著升高。与UUO组相比,肾脏组织HE染色和天狼星红染色结果显示,给予FK228干预在很大程度上改善了小鼠肾脏损害,减轻了肾小管的扩张程度及蛋白质管型,减少了间质中胶原的沉积(P0.05)。同时,FK228干预抑制了肾脏中纤维化相关蛋白如α-SMA、Collagen I及FN的表达(P0.05)。免疫组化结果显示,UUO+FK228组中F-actin的表达下调,表明FK228抑制了肾脏成纤维细胞的激活。蛋白水平检测显示,FK228使肾脏中HDAC1和HDAC2的表达减少(P0.05),乙酰化组蛋白H3的表达增加(P0.05)。【结论】在UUO诱导的小鼠肾脏间质纤维化中,HDAC1和HDAC2处于高表达状态。全身给予FK228后,通过抑制HDAC1和HDAC2的作用,促进组蛋白H3发生乙酰化,抑制成纤维细胞的激活,进一步减少炎性因子和纤维化相关指标的表达,从而发挥改善肾脏间质纤维化的作用。第二部分FK228抑制肾脏成纤维细胞的作用及机制研究【目的】探讨I类HDAC抑制剂FK228抑制肾脏间质成纤维细胞的作用及其机制,为FK228进一步临床应用提供实验依据。【方法】体外培养大鼠肾脏间质成纤维细胞系(NRK-49F),将细胞接种于96孔板中,每孔104个细胞,实验分组为:Control组、2n M、5n M、8n M、10n M、15n M、20n M、40n M、50n M、100n M、200n M、300n M;用CCK8方法检测不同浓度的FK228对NRK-49F细胞增殖的影响。将NRK-49F细胞接种于6孔板中,每孔4×105个细胞,实验分组为:Control组、TGF-β1组、TGF-β1+FK228(5n M)组、TGF-β1+FK228(8n M)组、TGF-β1+FK228(10n M)组、TGF-β1+FK228(15n M)组。培养过夜后,将完全培养基更换成含0.5%胎牛血清的培养基后继续培养24小时,然后用FK228预处理细胞40分钟,再用TGF-β1刺激培养24小时。通过流式细胞术分析FK228对NRK-49F细胞凋亡的影响。收集各组细胞,提取总蛋白和细胞核蛋白,利用Western blot方法检测不同浓度FK228干预对NRK-49F细胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1、E-cadherin、HDAC1、HDAC2、乙酰化组蛋白H3、Cyclin D1、P21、P27表达水平的影响,同时检测Smad2/3、MEK1/2、ERK1/2、P38的磷酸化水平,来评估FK228对成纤维细胞中TGF-β1/Smad信号通路ERK1/2和P38 MAPK信号通路的影响。【结果】TGF-β1组细胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表达水平明显高于Control组,而E-cadherin的表达下降。TGF-β1+FK228组细胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表达较TGF-β1组显著降低(P0.05),随着FK228浓度的增加,抑制作用逐渐增强。在TGF-β1组细胞中,HDAC1和HDAC2的蛋白水平明显升高,乙酰化的组蛋白H3几乎没有表达。而FK228能够浓度依赖性地抑制NRK-49F细胞中HDAC1和HDAC2的表达,同时使组蛋白H3处于高度乙酰化状态(P0.05)。此外,CCK8结果显示,FK228能够有效抑制NRK-49F细胞的增殖,并且当浓度为10n M和15n M时促进其凋亡。细胞周期蛋白的Western blot检测显示,FK228干预使细胞周期蛋白Cyclin D1的表达下调,同时使P21和P27的表达上调。在信号通路蛋白方面,Western blot结果显示,FK228干预大大降低了NRK-49F细胞中p-Smad2/3,p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-P38的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。【结论】FK228可抑制成纤维细胞的活化增殖,降低成纤维细胞中ECM的产生。机制与抑制HDAC1和HDAC2的作用,促进组蛋白H3的乙酰化,阻断TGF-β1/Smad、ERK1/2和P38 MAPK信号通路的活化有关。第三部分FK228对肾小管上皮细胞的作用及机制研究【目的】探讨I类HDAC抑制剂FK228对肾小管上皮细胞的作用及其机制。【方法】体外培养大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E),将NRK-52E细胞接种于6孔板中,每孔4×105个细胞,实验分组为:Control组、TGF-β1组、TGF-β1+FK228(5n M)组、TGF-β1+FK228(8n M)组、TGF-β1+FK228(10n M)组、TGF-β1+FK228(15n M)组。培养过夜后,将完全培养基更换成含0.5%胎牛血清的培养基后继续培养24小时,然后用FK228预处理细胞40分钟后,再用TGF-β1刺激培养24小时,收集各组细胞,提取总蛋白和细胞核蛋白。通过Western blot方法检测不同浓度FK228对NRK-52E细胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1、E-cadherin、HDAC1、HDAC2及乙酰化组蛋白H3表达水平的影响,在信号通路方面,利用Western blot检测Smad2/3、MEK1/2、ERK1/2、P38的磷酸化水平,来评估FK228对肾小管上皮细胞中TGF-β1/Smad信号通路、ERK1/2和P38 MAPK信号通路的影响。【结果】蛋白水平检测显示,与Control组相比,TGF-β1增加了NRK-52E细胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表达,且HDAC1和HDAC2的表达明显上调。FK228可浓度依赖的抑制这些蛋白的表达(P0.05),同时使组蛋白H3处于高度乙酰化水平(P0.05)。在信号通路蛋白方面,Western blot结果显示,FK228大大降低了NRK-52E细胞中p-Smad2/3、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-P38的表达水平(P0.05)。【结论】FK228抑制HDAC1和HDAC2的作用,使组蛋白H3处于高度乙酰化水平,从而抑制了肾小管上皮细胞中ECM蛋白的表达。机制与FK228抑制了TGF-β1/Smad、ERK1/2和P38 MAPK信号通路的活化有关。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692
【部分图文】：

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华中科技大学博士学位论文因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）在纤维化的进展中起关键作用[7]。TGF-β1是 TGF-β 家族中最常见的成员，由浸润的炎性细胞和所有类型的肾脏细胞分泌产生。反过来，TGF-β1 又作用于肾脏中的许多细胞，包括足细胞、肾小管上皮细胞、巨噬细胞和 T 细胞[8]。值得注意的是，TGF-β1 以无活性的形式分泌，并与组织中的潜在TGF-β 结合蛋白（latent TGF- -binding protein，LTBP）结合。它可以很容易地被活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）等各种刺激而激活，然后以活性 TGF-β1的形式释放出来[9]。TGF-β1 通过激活 Smad 通路和非 Smad 信号通路，诱导肾小管上皮细胞和成纤维细胞产生大量的 ECM 和炎性细胞因子，进一步引起肾小管间质的损伤和炎症，最终导致肾功能衰竭[10-12]（图 1，Pusoon Chun，2017）。由于肾脏纤维化是一个复杂且不可逆转的过程，尽管众多学者们对它的发病机制进行了广泛的研究，但目前仍然缺乏针对肾脏纤维化的有效治疗方法[13, 14]。

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HDAC8；（II）HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAirutin1-7；（IV）HDAC11[17]。一般来说，组蛋白去乙HDACi）有利于组蛋白乙酰化和染色质松弛，从而是 H3 和 H4，具有多个氨基酸残基，例如赖氨酸（L修饰，可调节基因的表达[18]。已有研究显示 HDAC殖和凋亡及减轻血管炎症，在肿瘤、高血压和房颤等-25]。HDACs 的广谱抑制剂，如伏立诺他（vorinostattatin A，TSA）能有效抑制心脏[21, 26]和肝脏[27-29]的纤的治疗靶点打下了基础。此外，HDACs 在许多肾脏，其中尤其是 HDAC1 和 HDAC2 在肾脏纤维化中处明，在 TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞中，HDAC1因此，若将 HDAC1 和 HDAC2 作为治疗靶点，对其有效地缓解肾脏纤维化呢？

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42图 1 FK228 对 UUO 术后肾脏病理学改变的影响。（A）HE 染色检测 UUO 术后 7小鼠肾脏的组织学变化，分别放大 100 倍和 200 倍。（B）天狼星红染色检测 UU后 7 天时小鼠肾脏间质胶原纤维的沉积情况，放大 200 倍。（C）用 Image J 软件狼星红染色阳性（染成红色）的面积进行半定量分析。***P<0.001 vs Sham 组，##0.001 vs UUO 组。

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