microRNA-214在膀胱癌中表达的生物学功能、调控机制及临床应用研究

发布时间：2020-09-16 16:56

　　研究背景膀胱癌(bladder cancer, BC)为泌尿系常见的恶性肿瘤之一,年新增病例38.63万,死亡病例15.02万,发病率在全球范围内排名恶性肿瘤第九位,致死率列全球男性泌尿生殖系统肿瘤第二位。发达国家中膀胱癌发病率排名男性恶性肿瘤第四位,于发展中国家排第七位。尽管75%的病例属于五年生存率较高的非肌层浸润膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer, NMIBC),另外25%的肌层浸润膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer, MIBC)在首次积极治疗后却容易发生转移。因此,探寻基于分子网络的新型治疗模式、早期诊断及预后标志物成为近年来的研究热点。microRNAs (miRNAs)系一类平均长度22个核苷酸、内源性、非编码、小RNA分子,通过与其靶mRNA分子3'非编码区(3'untranslated regions,3'-UTR)特异的碱基部分完全或不完全配对结合从而导致其发生降解或翻译抑制,于转录后水平调控基因表达。研究证实,miRNAs可调控60%的人类蛋白编码基因,并在多种病理生理进程中发挥关键作用。miRNAs既可作为抑癌基因又可作为原癌基因参与肿瘤的发生、发展。鉴于其疾病／组织特异性表达图谱及惊人的调控潜能,miRNAs已经成为肿瘤诊断及预后标志物。研究发现,microRNA-214 (miR-214)在恶性黑色素瘤中表达上调并参与疾病进展与肿瘤远处转移；而在宫颈癌、乳腺癌及肝细胞癌中则表达下调并发挥抑癌基因作用。以上证据表明miR-214在不同类型肿瘤发生过程中发挥重要、多样化作用,而其潜在机制有待进一步阐明。已有miRNA图谱研究证明膀胱癌中miR-214异常表达,然而目前国内外关于miR-214在膀胱癌中的功能分析及分子调控网络的报道很少。膀胱镜与尿脱落细胞学是当前膀胱癌诊断与预后监测的主要手段。然而前者具有侵入性、价格昂贵、很难发现扁平型肿瘤及原位癌；后者特异性高但对低分级的膀胱癌不敏感。因此,探寻新型、非侵入性、高敏感性、高特异性的循环标志物对于膀胱癌的早期诊断与预后判断尤为重要。研究表明,肿瘤特异性循环miRNAs可能成为非侵入性肿瘤标志物,因其由胞外管状结构(外来体)保护而免于被降解,故能稳定存在于多种体液中(包括血清、血浆、尿液、泪水、支气管灌洗液、初乳、母乳、脑脊液、胸水、腹水、精液、羊水)。本研究中,我们假定尿循环miR-214水平可以反映膀胱癌肿瘤组织中miR-214表达状态,探究其能否被检测、是否可成为非侵入性肿瘤标志物。明确循环miRNAs表达谱是否反映肿瘤组织miRNAs表达谱对于提高循环肿瘤标志物的总体诊断特异性至关重要。鉴于此,本课题旨在通过检测膀胱癌患者组织和尿液中miR-214的表达情况,并通过体外调控膀胱癌细胞系中miR-214基因表达水平、寻找并确定其下游靶基因、进行相关细胞功能实验,探究miR-214在膀胱癌早期诊断和预后判断中的价值及其在膀胱癌增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程中的功能意义和分子调控机制,为寻找膀胱癌诊断、预后及治疗新靶点提供依据。第一部分膀胱癌组织中miR-214分子表达及其与临床病理参数和预后间的关系目的：检测膀胱癌组织中miR-214分子表达情况,并探讨miR-214与膀胱癌临床病理参数和预后间的关系。方法：1.采用实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测106对膀胱癌新鲜冰冻组织(包括31例NMIBC和75例MIBC)及癌旁正常组织中miR-214分子含量。2.用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis检验分析miR-214表达情况与膀胱癌病人临床病理参数之间的关系。3.以单变量Kaplan-Meier生存分析描绘miR-214和其它变量的生存曲线,通过log-rank检验比较各生存曲线之间的差异。4.用多变量Cox比例风险回归模型评估miR-214及其它参数在膀胱癌中的预后价值。结果：1.与配对癌旁正常组织(中位相对表达量为0.864)相比,74%的膀胱癌组织中miR-214的表达水平(中位相对表达量为0.084)显著下调(P0.001)。2.膀胱癌组织中miR-214表达下调与患者的NMIBC病史(P=0.033)、肿瘤多发性(P=0.003)、较高的肿瘤临床分级(P0.001)、较高的肿瘤临床分期(P0.001)及较高的局部淋巴结转移状态(P0.001)呈显著相关性。3.随访期间,54.7%(58/106)的患者膀胱癌复发,五年总体生存率为61.3%(65/106)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,miR-214低表达组患者的无复发生存期(Reccurrence-free survival, RFS)(log-rank test=26.207; P0.001)和总体生存期(Overall survival, OS)(log-rank test=45.174; P0.001)均明显低于miR-214高表达组。多参数Cox比例风险回归模型分析显示miR-214表达水平并不是RFS(P=0.269)与OS(P=0.397)的独立预后因子。4.对NMIBC组与MIBC组分别进行分析,结果显示：NMIBC组中,54.8%(17/31)的患者出现复发,但Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-214下调无法预测RFS与OS；MIBC组中,54.7%(41/75)的患者出现局部或转移性复发,五年总体生存率为45.3%(34/75)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-214下调与膀胱癌预后不良密切相关(RFS:log-rank test=14.214, P0.001;OS:log-rank test=13.797, ?0.001)。Cox回归分析表明miR-214表达水平是RFS (RR=0.178;95%CI, 0.072-0.443;P0.001)与OS (RR=0.230;95%CI,0.097-0.547;P0.001)的独立预后因子。结论：miR-214分子于膀胱癌组织中表达下调,且与膀胱癌负面性临床病理特征显著相关,提示其可能在膀胱癌发生、发展过程中发挥重要作用；miR-214表达水平是MIBC患者RFS与OS独立的预后因子。4.用多变量Cox比例风险回归模型评估miR-214及其它参数在膀胱癌中的预后价值。结果：1.与配对癌旁正常组织(中位相对表达量为0.864)相比,74%的膀胱癌组织中miR-214的表达水平(中位相对表达量为0.084)显著下调(P0.001)。2.膀胱癌组织中miR-214表达下调与患者的NMIBC病史(P=0.033)、肿瘤多发性(P=0.003)、较高的肿瘤临床分级(P0.001)、较高的肿瘤临床分期(P0.001)及较高的局部淋巴结转移状态(P0.001)呈显著相关性。3.随访期间,54.7%(58/106)的患者膀胱癌复发,五年总体生存率为61.3%(65/106)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,miR-214低表达组患者的无复发生存期(Reccurrence-free survival, RFS)(log-rank test=26.207; P0.001)和总体生存期(Overall survival, OS)(log-rank test=45.174; P0.001)均明显低于miR-214高表达组。多参数Cox比例风险回归模型分析显示miR-214表达水平并不是RFS(P=0.269)与OS(P=0.397)的独立预后因子。4.对NMIBC组与MIBC组分别进行分析,结果显示：NMIBC组中,54.8%(17/31)的患者出现复发,但Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-214下调无法预测RFS与OS；MIBC组中,54.7%(41/75)的患者出现局部或转移性复发,五年总体生存率为45.3%(34/75)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-214下调与膀胱癌预后不良密切相关(RFS:log-rank test=14.214, P0.001;OS:log-rank test=13.797, ?0.001)。Cox回归分析表明miR-214表达水平是RFS (RR=0.178;95%CI, 0.072-0.443;P0.001)与OS (RR=0.230;95%CI,0.097-0.547;P0.001)的独立预后因子。结论：miR-214分子于膀胱癌组织中表达下调,且与膀胱癌负面性临床病理特征显著相关,提示其可能在膀胱癌发生、发展过程中发挥重要作用；miR-214表达水平是MIBC患者RFS与OS独立的预后因子。第二部分miR-214在膀胱癌致病中的生物学功能及调控机制研究目的：通过体外调控膀胱癌细胞系中miR-214基因表达水平、寻找并确定其下游靶基因、进行相关细胞功能实验,探究miR-214在膀胱癌致病中的生物学功能意义和分子调控机制。方法：1.采用qRT-PCR方法检测miR-214在正常人膀胱永生化上皮细胞(SV-HUC-1)和两种膀胱癌细胞系(T24、5637)中的表达情况。2.体外用脂质体2000将miR-214模拟物(miR-214 mimic)瞬时转染至膀胱癌细胞(T24、5637),同时设立阴性对照组(转染miR-214阴性对照,miR-NC组)和空白对照组(只转染脂质体,mock组);qRT-PCR方法评估各组转染效率；采用CCK8实验、划痕实验、Transwell实验及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测转染后细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的变化；Western blot分析转染后caspase-3与caspase-3裂解片段的含量变化。3.利用综合生物学信息分析平台starBase v 2.0,联合应用5种算法(targetScan、 picTar、PITA、RNA22和miRanda)寻找并确定miR-214的靶基因；构建靶基因野生型及突变型双荧光素酶报告载体(pmiR-ReportrTM vectors),与miR-214mimic或miR-NC共转染膀胱癌细胞(T24、5637),并用双荧光素酶报告系统进行验证；用qRT-PC及Western blot分别检测转染miR-214 mimic后膀胱癌细胞中靶基因mRNA及蛋白含量。4.应用qRT-PCR检测膀胱癌及癌旁正常组织中靶基因含量;采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-Wallis检验分析靶基因表达情况和膀胱癌患者临床病理参数之间的关系；以Kaplan-Meier法描绘靶基因的生存曲线,并用log-rank检验比较各生存曲线之间的差异；用Cox比例风险回归模型评估靶基因在膀胱癌预后判断中的价值。5.通过siRNA干扰膀胱癌细胞系(T24、5637)中靶基因的表达水平,用qRT-PCR及Western blot评估各组转染效率；采用CCK8实验、划痕实验、Transwell实验与Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术分析干扰后细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的变化；Western blot检测干扰后caspase-3及caspase-3裂解片段的含量变化。结果：1.miR-214在两种膀胱癌细胞中的表达与永生化上皮细胞相比显著下调(P0.001)。2.转染]miR-214 mimic 24h后,T24和5637细胞中miR-214含量分别是mock, miR-NC组的22319±2284倍(T24,P0.001)与10276±1836倍(5637,P0.001);与mock组、NC组比较,miR-214 mimic转染组细胞在转染后48h、72h、96h三个时间段里生长速度明显减缓,差异存在统计学意义(P0.001)；划痕实验中,转染24h后miR-214 mimic组伤口愈合率(T24,15.17%±2.86%；5637,43.33%±3.33%)明显低于mock组(T24,82.00%±1.41%;5637,75.67%±3.08%)和NC组(T24,80.83%±3.60%；5637,75.00%±3.52%),均有显著性差异(P0.001)；Transwell迁移实验中,T24细胞miR-214 mimic组穿膜细胞数为mock组的(49.46±4.36)%,5637细胞miR-214 mimic组穿膜细胞数为mock组的(25.42±2.36)%,存在统计学差异(P0.001)；Transwell侵袭实验中,miR-214mimic组细胞的穿膜率(T24,11.67%±3.72%；5637,3.40%±0.32%)明显低于mock组(T24,41.17%±6.21%；5637,26.17%±3.19%)和NC组(T24,40.50%±5.79%;5637,25.17%±4.07%),均存在显著性差异(P0.001)；转染膀胱癌细胞24h后,miR-214 mimic组的凋亡率(T24,57.10%±2.85%；5637,41.94%±2.84%),明显高于mock组(T24,18.61%±1.56%；5637,12.72%±3.26%)和NC组(T24,18.81%±1.57%；5637,13.05%±3.17%),差异皆具统计学意义(P0.001)；转染48h后,miR-214 mimic 组 caspase-3与caspase-3裂解片段蛋白含量均明显高于NC组。3.四种算法(targetScan、picTar、PITA与miRanda)一致预测PDRG1的3'-UTR存在miR-214的互补结合位点；双荧光素酶报告系统结果证实PDRG1为miR-214的下游靶基因(P0.001)；与]mock组、NC组比较,miR-214 mimic组PDRG1 mRNA(P0.001)及蛋白含量均明显降低。4.与配对癌旁正常组织(中位相对表达量为0.00024)相比,81%的膀胱癌组织中PDRG1的表达水平(中位相对表达量为0.00632)显著上调(P0.001)。PDRG1与miR-214在膀胱癌组织中表达呈负相关(r=-0.367,P0.001)。膀胱癌组织中PDRG1表达上调与患者的性别(P=0.012)、较高的肿瘤临床分级(P=0.001)、较高的肿瘤临床分期(P0.001)及较高的局部淋巴结转移状态(P0.001)显著相关。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,PDRG1高表达组患者的RFS(log-rank test=6.578;P=0.010)和OS (log-rank test=8.990; P=0.003)均明显低于PDRG1低表达组。Cox回归模型分析显示PDRG1表达水平并不是RFS (P=0.457)与OS(P=0.145)的独立预后因子。对NMIBC组与MIBC组分别进行分析显示,PDRG1表达量均无法预测各组的RFS与OS。5.转染si-PDRG1 24h后,T24和5637细胞中PDRG1mRNA含量分别是mock组的0.33±0.09倍(T24,P0.001)与0.57±0.05(5637,P0.001)倍；与mock组、NC组相比,si-PDRG1转染组细胞在转染后48h、72h、96h三个时段里生长速度明显变缓,存在显著性差异(P0.001)；划痕实验中,si-PDRG1组伤口愈合率(T24,20.67%±2.42%；5637,52.00%±5.97%)明显低于mock组(T24,81.00%±1.55%；5637,73.83%±2.93%)和NC组(T24,79.00%±3.52%；5637,71.83%±1.94%),差异皆具统计学意义(P0.001)；Transwell迁移实验中,T24细胞si-PDRG1组穿膜细胞数为mock组的(55.78±11.23)%,5637细胞si-PDRG1组穿膜细胞数为mock组的(35.59±2.28)%,皆具显著性差异(P0.001)；Transwell侵袭实验中,si-PDRG1组细胞的穿膜率(T24,14.33%±2.94%；5637,7.00%±2.61%)明显低于mock组(T24,44.50%±2.35%；5637,31.00%±2.61%)和NC组(T24,43.83%±2.99%；5637,29.67%±4.89%),差异存在统计学意义(P0.001)；转染24h后,si-PDRG1组的凋亡率(T24,52.83%±4.23%;5637,34.75%±3.39%)明显高于mock组(T24,16.89%±1.69%;5637,11.16%±2.51%)和NC组(T24,17.07%±1.82%；5637,11.41%±2.50%),均有显著性差异(P0.001)；转染48h后,si-PDRG1组,PDRG1蛋白含量明显低于NC组,而caspase-3与caspase-3裂解片段蛋白含量明显高于NC组。结论：本研究首次证实miR-214在膀胱癌中发挥抑癌基因作用,其通过直接下调癌基因PDRG1,从而抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡；同时本研究也为膀胱癌靶向基因治疗提供实验依据。OS(P=0.145)的独立预后因子。对NMIBC组与MIBC组分别进行分析显示,PDRG1表达量均无法预测各组的RFS与OS。5.转染si-PDRG1 24h后,T24和5637细胞中PDRG1mRNA含量分别是mock组的0.33±0.09倍(T24,P0.001)与0.57±0.05(5637,P0.001)倍；与mock组、NC组相比,si-PDRG1转染组细胞在转染后48h、72h、96h三个时段里生长速度明显变缓,存在显著性差异(P0.001)；划痕实验中,si-PDRG1组伤口愈合率(T24,20.67%±2.42%；5637,52.00%±5.97%)明显低于mock组(T24,81.00%±1.55%；5637,73.83%±2.93%)和NC组(T24,79.00%±3.52%；5637,71.83%±1.94%),差异皆具统计学意义(P0.001)；Transwell迁移实验中,T24细胞si-PDRG1组穿膜细胞数为mock组的(55.78±11.23)%,5637细胞si-PDRG1组穿膜细胞数为mock组的(35.59±2.28)%,皆具显著性差异(P0.001)；Transwell侵袭实验中,si-PDRG1组细胞的穿膜率(T24,14.33%±2.94%；5637,7.00%±2.61%)明显低于mock组(T24,44.50%±2.35%；5637,31.00%±2.61%)和NC组(T24,43.83%±2.99%；5637,29.67%±4.89%),差异存在统计学意义(P0.001)；转染24h后,si-PDRG1组的凋亡率(T24,52.83%±4.23%;5637,34.75%±3.39%)明显高于mock组(T24,16.89%±1.69%;5637,11.16%±2.51%)和NC组(T24,17.07%±1.82%；5637,11.41%±2.50%),均有显著性差异(P0.001)；转染48h后,si-PDRG1组,PDRG1蛋白含量明显低于NC组,而caspase-3与caspase-3裂解片段蛋白含量明显高于NC组。结论：本研究首次证实miR-214在膀胱癌中发挥抑癌基因作用,其通过直接下调癌基因PDRG1,从而抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡；同时本研究也为膀胱癌靶向基因治疗提供实验依据。第三部分尿液游离miR-214的检测及其对膀胱癌诊断和预后价值的评估目的：评估尿游离miR-214对膀胱癌潜在的诊断和预后价值。方法：1.筛查阶段通过qRT-PCR法检测两种膀胱癌细胞(T24、5637)培养液上清以评估miR-214的分泌性,并检测20例膀胱癌患者与20例健康对照者尿游离miR-214表达。2.确证阶段采用qRT-PCR法测定272例膀胱癌术前尿、80例配对术后尿、169例健康对照者尿液中游离miR-214水平及79例配对膀胱癌组织中miR-214水平。3.用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis检验分析尿游离miR-214表达情况和膀胱癌病人临床病理参数之间的关系。4.通过受试者工作曲线(receiver operating characteristic, ROC)评估尿游离miR-214对膀胱癌的诊断效能。5.以单变量Kaplan-Meier法描绘尿游离miR-214的生存曲线,并用log-rank test比较各生存曲线之间的差异。6.用多变量Cox比例风险回归模型评估尿游离miR-214对膀胱癌的预后价值。结果：1.膀胱癌细胞分泌miR-214分子至培养液中,且筛查阶段膀胱癌患者尿游离miR-214水平明显低于健康对照者(P0.001)。2.确证阶段膀胱癌患者术前尿游离miR-214水平与健康对照者相比明显降低(P0.001),且术后显著性升高(P0.001)。膀胱癌患者术前尿游离miR-214与配对肿瘤组织中miR-214表达水平显著正相关(r=0.6539,95% CI=0.5010-0.7673,P0.001)。3.膀胱癌患者尿游离miR-214表达下调与患者的年龄(P=0.028)、NMIBC病史(P=0.044)、较高的肿瘤临床分级(P0.001)、较高的肿瘤临床分期(P0.001)、较高的局部淋巴结转移状态(P0.001)之间相关性明显。4.尿游离miR-214诊断膀胱癌的ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.838(95% CI=0.796-0.875),最佳临界值为0.1551,诊断敏感性为90.53%,特异性为65.62%,阳性预测值为69.90%,阴性预测值为88.70%。5.随访过程中,58.9%(113/192)的膀胱癌患者出现肿瘤复发,五年总体生存率为57.3%(110/192)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,尿游离miR-214低表达组患者的RFS (log-rank test=29.734;P0.001)和OS (log-rank test=61.711; P0.001)均明显低于miR-214高表达组。多参数Cox比例风险回归模型分析显示尿游离miR-214表达水平并不是RFS(P=0.277)与OS(P=0.667)的独立预后因子。6.对NMIBC组与MIBC组分别进行分析,结果显示：NMIBC组中,49.2%(31/63)的患者出现复发,但Kaplan-Meier生存曲线分析表明尿游离miR-214下调无法预测RFS与OS；MIBC组中,63.6%(82/129)的患者出现局部或转移性复发,五年总体生存率为36.4%(47/129)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示尿游离miR-214下调与膀胱癌预后不良密切相关(RFS:log-rank test=37.381,P0.001; OS:log-rank test=37.376, P0.001). Cox回归分析表明尿游离miR-214表达水平是RFS(RR=0.264; 95%CI,0.149-0.468;P0.001)与OS(RR=0.282;95%CI,0.160-0.495;P0.001)的独立预后因子。结论：尿游离miR-214可作为膀胱癌肿瘤分层、早期诊断及预后判断的有前景的无创性标志物。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.14

【参考文献】