2型糖尿病肾病甲基化图谱的构建及差异甲基化基因的筛选

发布时间：2020-09-16 17:09

　　背景近年来,糖尿病发病率持续增高,其常见并发症糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者中发生率高达20%~40%,为社会造成了沉重的经济负担。然而,DN的发病机制复杂,至今仍未彻底阐明。2型DN是典型的基因效应与环境因素相互作用而导致的复杂性疾病,表观遗传学机制在其发生发展中发挥着重要作用。然而,DN表观遗传学研究仍处于起步阶段,目前尚无针对DN患者肾组织甲基化状态改变的研究。因此,本研究拟利用DN患者的肾组织绘制DNA甲基化图谱,并结合生物信息学分析,以探寻在DN发生过程中出现的特异性甲基化改变和相关信号通路,为后续治疗靶点的探寻奠定基础。目的1.率先绘制2型DN患者肾组织全基因组DNA甲基化图谱,为后续人类DN表观遗传学的研究提供依据;2.通过DNA甲基化图谱的绘制和生物信息学分析,筛选出数个2型DN患者中特有的甲基化差异位点,有助于DN治疗靶点的探寻,从而为精准治疗和个体化无创诊断奠定基础。方法1.标本来源:非糖尿病患者7例(癌旁组织)、T2DM患者7例(癌旁组织)、2型DN患者7例(肾穿刺组织)和2型非糖尿病性肾脏疾病(non-diabetic renal disease,NDRD)患者8例(其中膜性肾病3例,Ig A肾病3例和局灶阶段性肾小球硬化症2例,均为肾穿刺组织),诊断标准均为肾脏病理检查确诊;2.全基因组甲基化测序和甲基化图谱的绘制:借助Illumina二代高通量测序平台并结合全基因组重亚硫酸盐处理技术,完成全基因组甲基化测序和DNA甲基化图谱的绘制;3.生物信息学分析:通过甲基化差异分析和GO、KEGG分析,得到与DN密切相关的信号通路,锚定数个与DN发病机制相关的基因位点。结果1.率先完成了DN患者肾组织DNA甲基化图谱的绘制;2.发现了DN组和NDRD组之间649个甲基化差异区域,在DN组和DM组之间,发现了609个甲基化差异区域;综合分析后,有160个甲基化差异区是DN组既不同于NDRD组又不同于DM组的位点;3.结合甲基化水平差异分析和相关富集分析,发现了Hippo信号通路,泛酸盐,CoA生物合成,内吞作用和细胞黏附分子等生化代谢通路和信号转导通路与DN组的相关度最高;4.结合甲基化差异程度和富集程度,进一步锚定了7个排名最高且与DN发病机制相关的基因位点:CTGF,MMP-9,MTHFR,let-7a-3,ITGB1,PANK1和Mst1。结论Hippo信号通路,泛酸盐,CoA生物合成,内吞作用和细胞黏附分子等生化代谢通路和信号转导通路在DN的发生发展中发挥着重要作用,CTGF,MMP-9,MTHFR,let-7a-3,ITGB1,PANK1和Mst1基因在DN组中的甲基化差异程度和富集程度排名最高,可能成为未来DN的治疗靶点或无创诊断标志物。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

流程图,文库构建,流程图

2.4.1甲基化WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing）文库的构建我们用纯度，浓度及完整性质量均合格的 1ug 基因组 DNA 样品进行起始建，C-T 转化根据 EZ DNAMethylation-Gold Kit DNA 甲基化试剂盒（D5006）法及操作说明进行重亚硫酸盐处理和 WGBS 文库的构建。对基因组 DNA 用声波随机打断成长度为 200bp 左右的小片段，然后进行末端修复，加入碱基 A，再加上测序接头，随后将其用重亚硫酸盐进行处理，把未发生甲基化的胞啶 C 转换为尿嘧啶 U，而发生甲基化的胞嘧啶 C 则不发生改变，经过筛选后，符合要求的片段进行 PCR 扩增，具体流程主要包括以下几个内容：（1））DNA 片段化（Fragment DNA）；（2）末端修复（End Repair）；（3）末端加“A”（A-Tailing）；（4）甲基化接头连接（Ligate MethylatedAdapter）；（5）2%琼脂糖凝胶进行片段选择，切胶回收目的片段；（6）Bisufile 处理（C-T 转化）和回收；（7）PCR 扩增 WGBS 文库。

示意图,测序,流程,示意图

2.4.2 WGBS文库构建的质控待文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 荧光定量仪进行初步定量，随后使用 Aglient 2100 Bioanalyzer 对文库的插入片段大小（insert size）进行检测，insersize 符合预期后，使用 StepOnePlusTMReal-Time PCR system 进行 Q-PCR 检测，对文库的有效浓度进行准确定量（文库浓度＞10nM 视为有效），以保证文库质量。2.5 高通量测序及质量控制经检测合格后，进行高通量测序。2.5.1高通量测序的情况采用Illumina公司的Illumina Hiseq Xten测序仪，测序策略为PE150（pair-end 150bp），即两端各测150bp的序列，平均测序深度在30X以上，然后与参考基因组进行配对，得到的唯一与参考基因组匹配的胞嘧啶甲基化信息用于后续甲基化信息分析。

流程图,信息分析,质控,测序

化为Clean Reads，用于后续信息分析，如下：（1）剔除接头被污染的Reads（双端测序中，如果有一端超过5bp的序列到接头污染，则同时剔除两端Reads）；（2）剔除质量较低的Read（s如果质量值Q低于19的碱基数目占总碱基数的比例超过15％，则视为质量低；双端测序中，若有一端Reads的质量较低同时剔除两端Reads）；（3）剔除含N（N表示任何一个碱基，由于测序质量太差，故软件无法别是哪个碱基）比例超过10%的Reads（双端测序中，如果有一端Reads的比超过5%，则同时剔除两端Reads）第二部分肾组织全基因组 DNA 甲基化图谱的构建

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