神经端侧吻合和FK1706促进大鼠神经源性膀胱形态功能恢复的研究

发布时间：2020-09-16 18:42

　　 背景和目的神经源性膀胱(neurogenic bladder,NB)是神经源性膀胱尿道功能障碍的简称,由神经本身的病变或者外伤、手术等对神经损害所引起,临床表现特征为膀胱逼尿肌或(和)尿道括约肌的功能障碍导致储尿和排尿异常。NB患者晚期可因NB所致的泌尿系感染和肾功能衰竭而死亡。NB临床多见,但发病机制不完全清楚,治疗困难。在过去的几十年中,很多方法用来治疗NB,这些方法可在一定程度上改善膀胱的排尿和储尿功能,但不能从根本上恢复膀胱神经支配,临床效果不佳。目前唯一有效的在临床应用的治疗NB的方法是骶神经调节术,但也需要更多的临床病例来验证。2001年Xiao教授首先提出了神经吻合治疗脊髓损伤和脊柱裂等引起的NB,并且报道其方法有一定的效果,后来国外的Chang和Havton教授也报道了神经吻合治疗NB有一定效果。2011年,在这方面研究较多的国内专家侯春林教授通过不同的神经吻合方式证实了神经吻合治疗NB有一定的效果。但是,2015年Rasmussen教授根据自己的研究发现,神经吻合对于治疗脊髓损伤引起的下尿路功能障碍没有作用。由于神经吻合治疗NB效果仍有争议,从动物实验进行深入研究神经吻合是否能够治疗NB很有必要。2012年Gao通过建立腰骶部脊神经离断神经源性膀胱模型并进行神经端侧吻合,通过逆行神经示踪和电刺激等技术证明神经端侧吻合在大鼠NB模型中有一定的治疗作用。但是其没有进行尿动力学检查,因此不能充分证明神经端侧吻合对于恢复NB大鼠膀胱功能的作用。因此,对神经端侧吻合后的大鼠进行尿动力学检查和膀胱形态学检测,来研究神经端侧吻合对于腰骶部脊神经离断引起的NB大鼠膀胱功能及形态的恢复很有必要。导致神经吻合效果不好的一个重要因素是神经的生长速度慢,从损伤到去神经的靶器官实现神经重建所需要的时间的长短对于靶器官功能恢复有重要影响。因此开发出促进神经再生的药物将会有很大的帮助。神经生长因子(NGF)和神经营养因子家族的其他成员对神经元的存活和分化至关重要,但其不利的药代动力学(必须通过注射方式给药和脑渗透性差)以及非特异性作用和毒性限制了其在临床上的全身应用。能够增强神经营养因子信号传导以及克服这些障碍的化合物可能显示更大的治疗潜能。他克莫司(tacrolimus,FK506)是一种广泛应用的免疫抑制剂,国内外学者在临床应用中发现FK506不仅有免疫抑制的作用,还具有神经营养和神经保护作用。但是,当进行自体神经吻合或只需要发挥神经营养和神经保护作用时,免疫抑制不可避免地成了副作用。非免疫抑制神经免疫亲和素配体FK1706是免疫抑制神经免疫亲和素配体FK506的一种衍生物,与FK506相比,免疫抑制作用减弱,至少在发挥神经营养作用的剂量下没有明显的免疫抑制作用。本团队前期工作已经初步证实FK1706有促进NB大鼠神经吻合后神经生长的效果。建立NB大鼠模型,通过尿动力学和膀胱形态学测定来进一步了解FK1706是否能通过促进神经端侧吻合后神经再生来改善NB大鼠膀胱功能和形态很有必要。此外,神经免疫亲和素配体FK1706促进神经轴突再生的作用机制目前仍不明确。一种假说认为FK1706通过与FKBP12结合形成FKBP复合物抑制钙调磷酸酶的活性,钙调磷酸酶可以抑制生长相关蛋白43(Growth-Associated-Protein43,GAP43)的表达和活性,而GAP43是神经元生长锥内磷酸蛋白的主要成分,是外周神经再生时位于生长锥内最具活性的一类蛋白,在外周神经的再生中具有重要的作用。FK1706通过抑制钙调磷酸酶而促进GAP43的表达和活性,从而发挥促进神经生长的作用。另一种假说认为FK1706促进神经再生的作用和FKBP12无关,而是通过与神经元胞膜上的FKBP52结合促使热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)从类固醇受体复合物(FKBP52/Hsp90/p23/SR)中解离,解离的Hsp90通过调节NGF发挥作用的Ras/Raf/MEK/ERK信号通路来增强NGF促进神经再生的作用,另外解离出的p23也可能促进神经再生。Gold对敲除FKBP12的小鼠海马细胞原代培养发现,神经免疫亲和素配体仍然有增强NGF促进神经再生的作用,说明FKBP12对于免疫亲和素配体促进神经再生不是必须的。Gold认为是FKBP52而非FKBP12介导了免疫亲和素配体的神经营养作用,并且通过将FKBP52抗体作用于加入免疫亲和素配体的SH-S Y5Y细胞培养基,发现FKBP52抗体能够阻断免疫亲和素配体增强NGF促进神经增长作用,说明FKBP52才是免疫亲和素配体增强NGF促进神经再生关键。Price研究表明FK1706是通过增强NGF促进神经再生发挥神经营养作用的,但是FK1706与FKBP52结合后如何增强NGF作用,进而促进神经再生目前未知,也就是他们之间的衔接点不明确。因此,要想明确FK1706发挥神经营养作用的具体机制,研究FK1706与FKBP52结合后如何促进NGF的作用非常必要。因此,本研究的主要目的包括:①建立腰骶部脊神经离断及吻合成年SD大鼠NB模型,并进行尿流动力学检查及膀胱形态学检测,探讨神经端侧吻合对NB大鼠膀胱形态和功能的恢复作用;②建立腰骶部脊神经离断再吻合成年SD大鼠NB模型,并应用FK1706,探讨FK1706通过促进端侧吻合后神经再生对NB大鼠膀胱功能和形态的改善作用;③培养SH-SY5Y细胞,并给予FK1706、NGF和Geldanamycin等干预,探讨FK1706增强NGF促进SH-SY5Y细胞的轴突延长的机制。第一部分:成年SD大鼠NB模型的建立及神经吻合后膀胱功能及形态学研究材料和方法1.50只健康成年雄性SD大鼠,体重(280±20)g,按照随机数字表法分为神经端侧吻合组(end-to-side nerve coaptation group,ECG,n=20)、未吻合组(no coaptation group,NCG,n=20)和对照组(control group,CG,n=10)。麻醉后,打开椎管暴露L3-S1脊髓节段,分离脊神经,ECG组切断左侧L6和S1脊神经,然后将左侧L6脊神经残端的远端在L4水平吻合到左侧L4脊神经的侧面;NCG组切断左侧L6和S1脊神经,不进行神经吻合;CG组不进行任何处理作为正常对照。2.术后4个月,再次麻醉大鼠,暴露盆神经节,用微量注射器将4%荧光金(FluoroGold,FG)注入左侧盆神经节。7天后,对各组大鼠进行膀胱压力容积测定、电刺激测定膀胱压力变化。压力测定后,取膀胱进行称重,之后将膀胱组织置于10%的中性福尔马林,石蜡包埋,进行切片,然后进行HE(hematoxylin andeosin,HE)和VG(VanGieson,VG)染色,10%的中性福尔马林通过心脏灌注全身,然后取L3-S1的脊髓组织,进行冰冻切片。记录并比较各组大鼠的充盈期最大膀胱测压容积、排尿期最大逼尿肌压力、残余尿量、膀胱纤维化面积、脊髓组织荧光标记细胞等。3.统计学处理:应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。以α = 0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.逆行神经示踪:荧光显微镜下观察各组大鼠不同脊髓节段FG标记的神经元。ECG大鼠,FG标记的神经元主要位于L4脊髓节段,L6和S1脊髓节段未观察到FG标记的神经元;NCG大鼠,L3-S1脊髓节段均未观察到FG标记的神经元;CG大鼠,FG标记的神经元主要分布在L6和S1脊髓节段,L4脊髓节段未观察到FG标记的神经元。2.膀胱压力容积测定:NCG大鼠和ECG大鼠充盈期最大膀胱测压容积、残余尿量和膀胱顺应性较CG大鼠明显增加,但ECG大鼠最大膀胱测压容积、残余尿量及膀胱顺应性较NCG有明显改善;CG大鼠和ECG大鼠排尿期最大逼尿肌压无明显差异,但都大于NCG大鼠。电刺激CG大鼠左侧L6脊神经前根,引起膀胱收缩并触发排尿,平均最大逼尿肌压为(35.8±3.3)mmHg,电刺激ECG大鼠吻合口近端L4脊神经前根,引起膀胱收缩并触发排尿,平均最大逼尿肌压为(18.1±2.2)mmHg,电刺激NCG大鼠L4脊神经前根(与ECG大鼠相同部位),膀胱压力无明显变化,也没有排尿现象发生。3.膀胱湿重及形态学测定:测压后称取膀胱湿重,发现ECG和NCG大鼠膀胱湿重较对照组增加,但ECG大鼠膀胱湿重较NCG轻。取膀胱组织做石蜡切片,然后进行HE和VG染色。膀胱HE切片显示:CG大鼠HE染色显示正常的上皮和肌层,ECG和NCG大鼠膀胱HE染色显示肌层紊乱且水肿,但是ECG肌层紊乱和水肿的程度较NCG轻。VG染色显示:ECG和NCG大鼠膀胱纤维化程度较CG高,但ECG大鼠膀胱纤维化程度较NCG低。第二部分:FK1706对NB大鼠神经吻合后神经再生及膀胱形态功能的研究材料和方法1.50只健康成年雄性SD大鼠,体重(280±20)g。按照随机数字表法分为FK1706+神经端侧吻合组(FK1706 + end-to-side nerve coaptation group,FK1706+ECG,n=20)、神经端侧吻合组(ECG,n=20)和手术对照组(surgical control group,SCG,n=10)FK1706+ECG大鼠麻醉成功后,打开椎管,分离脊神经,离断左侧L6和S1脊神经前后根,然后将左侧L6前根端侧吻合到左侧L4前根上,术后连续8周给予皮下注射FK1706溶液;ECG大鼠的手术方法和FK1706+ECG大鼠相同,术后连续8周注射相同剂量的30%DMSO;SCG大鼠离断L6后根和S1前后根,作为手术对照组,术后连续8周注射相同剂量的30%DMSO。2.术后4个月,进行电刺激膀胱压力测定,清醒状态下膀胱压力容积测定,取膀胱标本行HE和VG染色,取节前盆副交感神经行western blot和qPCR检测及半薄切片神经形态学检测。记录并比较各组大鼠的充盈期最大膀胱测压容积、排尿期最大逼尿肌压力、残余尿量、膀胱纤维化面积、节前盆副交感神经(pelvic parasympathetic nerve,PPN)中神经纤维数量及节前PPN中神经再生相关蛋白的表达等。3.统计学处理:应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。以α= 0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.膀胱压力容积测定:FK1706+ECG和ECG大鼠的充盈期最大膀胱测压容积、残余尿量和膀胱顺应性较SCG大鼠的明显增加,但是FK1706+ECG大鼠的最大膀胱测压容积、残余尿量和膀胱顺应性低于ECG大鼠。三组大鼠的排尿期最大逼尿肌收缩压无明显统计学差异。电刺激SCG大鼠L6VR时,可以观察到膀胱内压升高,升高值为[(34.6±3.8)mmHg],电刺激L4VR没有观察到膀胱压力变化;电刺激FK1706+ECG和ECG大鼠吻合口近端L4VR时,可以观察到大鼠膀胱内压升高,升高值分别为[(22.3±2.7)mmHg]和[(17.8±3.1)mmHg]。电刺激后SCG大鼠的膀胱内压升高大于FK1706+ECG大鼠和ECG大鼠,且FK1706+ECG大鼠的膀胱内压升高大于ECG大鼠(P0.001)。2.膀胱湿重及形态学测定:测压后称取膀胱湿重,发现FK1706+ECG大鼠和ECG大鼠膀胱湿重较SCG组增加,但FK1706+ECG大鼠膀胱湿重较ECG大鼠轻。HE染色显示:SCG大鼠膀胱组织形态正常,上皮扁平,肌束排列整齐,肌束间结缔组织紧密;FK1706+ECG和ECG大鼠膀胱肌层排列不规则,并且有水肿,但FK1706+ECG大鼠相对较轻。VG染色显示:FK1706+ECG大鼠和ECG大鼠膀胱纤维化面积明显大于SCG大鼠膀胱纤维化面积,但是FK1706+ECG大鼠膀胱纤维化程度较ECG大鼠轻。3.大鼠节前PPN神经形态学观察:FK1706+ECG大鼠和ECG大鼠节前PPN半薄切片中有髓神经纤维的数量都小于SCG大鼠有髓神经纤维数量(717.5 ±29.1)。另外,FK1706+ECG大鼠节前PPN有髓神经纤维数量(590.4 ±55.6)明显大于ECG组大鼠有髓神经纤维数量(392.6 ±38.8)。4.神经生长相关蛋白的表达量的变化:曝光后,经灰度分析软件分析,三组大鼠节前PPN中S100、GAP43和βⅢ微管蛋白三种蛋白在三组中的相对表达量均有统计学差异。其中FK1706+ECG大鼠中三种蛋白的表达量最高,ECG大鼠次之,而SCG大鼠表达量最低。5.神经生长相关蛋白qPCR结果:三种轴突再生相关的标记物(S100、GAP43和βⅢ微管蛋白)在三组大鼠中mRNA水平的表达量差异有统计学意义,FK1706+ECG大鼠表达量最高,ECG大鼠次之,而SCG大鼠表达量最低。经公式2-△△Ct计算各组大鼠三种标记物mRNA表达量的相对倍数,结果显示FK1706+ECG 的 S100β 是 SCG 的 2.1 倍,ECG 的 S100β 是 SCG 的 1.8 倍;FK1706+ECG 的 GAP43 是 SCG 的 2.2 倍,ECG 的 GAP43 是 SCG 的 1.5 倍;FK1706+ECG的βⅢ微管蛋白是SCG的2.3倍,ECG的βⅢ微管蛋白是SCG的1.9 倍。第三部分:FK1706增强NGF促进周围神经轴突再生及机制的初步实验研究材料和方法1.培养SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞,制成单细胞悬液,调整细胞密度为1×105/ml,每孔加入100μl细胞悬液,均匀铺在96孔板中,待细胞贴壁后,按对照组、NGF(10ng/ml)、FK1706(lnM)+NGF、FK1706+NGF+geldanamycin(10ng/ml)分组处理,每组处理3个重复,培养24小时,提取蛋白通过Western blot进行p-Raf-1蛋白分析。测定细胞轴突长度:每组处理5个重复,培养96h后,拍照,测量细胞突起,每个重复3个视野。2.统计学处理:应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。以α = 0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.为了观察FK1706增强NGF促进SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞轴突延长的作用及初步研究其作用机制,分别将细胞进行了分组并做了不同的处理。结果NGF组细胞突起长度明显长于对照组细胞的突起长度,差异有统计学意义。并且FK1706+NGF组细胞突起长度又明显长于NGF组细胞的突起长度,差异有统计学意义。对于FK1706+NGF+ Geldanamycin组,细胞突起长度比FK1706+NGF组细胞突起长度缩短,差异有统计学意义。2.曝光后,经灰度分析软件分析,发现NGF组p-Raf-1蛋白相对表达量明显较对照组增加,FK1706+NGF组p-Raf-1蛋白相对表达量较NGF组增加,而FK1706+NGF+Geldanamycin 组 p-Raf-1 蛋白相对表达量较 FK1706+NGF 组明显降低。第四部分:结论通过上述三部分实验结果得出如下结论。1.大鼠L6和S1脊神经离断可以引起神经源性膀胱;2.大鼠L4VR和L6VR神经端侧吻合可以重建新的神经通路,恢复膀胱的神经支配;3.大鼠L4VR和L6VR神经端侧吻合可以部分恢复因腰骶部脊神经离断引起的NB大鼠受损的膀胱形态和功能;4.大鼠L4VR和L6VR神经端侧吻合后应用FK1706能够促进神经再生;5.FK1706能够通过促进L6VR和L4VR端侧吻合后神经再生来改善腰骶部脊神经离断引起的NB大鼠受损的膀胱形态和功能;6.FK1706能够增强NGF促进神经再生的作用,且与FK1706和FKBP52结合后解离的Hsp90与Ras/Raf/MAPK信号通路中的Raf-1的相互作用有关。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R694.5
【部分图文】：

图１．１实验分组示意图和吻合大体图（Ｘｉｏ）逡逑

危履Ｐ偷慕缟⒓吧窬酖呛虾蟀螂坠δ芗靶翁囔а绣常]3?附图逡逑ｉｔ邋ｉｌｌ逡逑图１．１实验分组示意图和吻合大体图（Ｘｉｏ）逡逑Ａ：对照组示意图；Ｂ：未吻合组示意图；Ｃ：Ｌ４ＶＲ和Ｌ６ＶＲ端侧吻合组示意图；ＤN４ＶＲ和逡逑Ｌ６ＶＲ端侧吻合大体图；Ｅ：邋Ｌ６ＶＲ和Ｌ４ＶＲ端侧吻合四个月后大体图。ＤＲ：ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔ，后逡逑根；ＶＲ：邋ｖｅｎｔｒａｌ邋ｒｏｏｔ，前根；ＣＧ：邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，对照组；ＮＣＧ：邋ｎｏ邋ｃｏａｐｔａｔｉｏｎ邋ｇｒｏｕｐ，未吻合逡逑组；ＥＣＧ：邋ｅｎｄ－ｔｏ－ｓｉｄｅ邋ｃｏａｐｔａｔｉｏｎ邋ｇｒｏｕｐ邋端侧吻合组；Ｌ：邋ｌｅｆｔ，左侧；Ｒ：邋ｒｉｇｈｔ，右侧；Ｐ：邋ｐｒｏｘｉｍａｌ，逡逑近端；Ｄ：邋ｄｉｓｔａｌ，远端。逡逑－？除坑压力定逡逑－？~|根力测定逡逑盆神经节＋逡逑ＥＣＧ—｜逦ｆ注射荧光金逡逑分组逦一邋

本文编号：2820229