SIgA通过TLR4介导系膜细胞分泌炎症因子及其机制研究

发布时间：2020-09-18 15:41

　　 研究背景:IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是由法国病理学家Berger和Hinglais于1968年发表在d’Urologie et Néphrologie杂志上,所以IgAN又被称为Berger病。后来,它被证明是全球范围内人类原发性肾小球肾炎最常见的类型,也是我国终末期肾脏病的主要原因,现在发病呈逐年上升趋势。IgAN的确诊主要依赖于肾脏病理活检,镜下主要特征为:肾小球系膜区IgA或以IgA为主的免疫复合物沉积,同时可能伴有不同程度的系膜细胞的增殖和基质的堆积。据最新的研究显示:亚洲地区肾活检IgAN的检出率约50%,而我国IgAN的发病率高达45%。在大多数情况下,IgAN患者约10-30%在10年内可进展为肾功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)。因其主要累及青年人,给家庭和社会带来沉重负担。但目前IgAN发病机制尚未完全阐明,因此对IgAN发病机制进行探讨是非常必要的。既往一系列研究及我们的前期结论均显示:粘膜免疫及其重要的效应蛋白-分泌型IgA(Secretory IgA,SIgA)在IgAN发病中发挥着重要作用。IgAN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿。全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)结果显示IgAN风险相关的大多数基因组也与粘膜免疫有关;且粘膜相关抗原免疫小鼠可诱导IgAN动物模型;逐渐增多的针对粘膜免疫的治疗应用于IgAN也得到了一定的疗效,SIgA是参与人体粘膜免疫的最重要抗体,其主要由粘膜淋巴组织B细胞产生,主要分布在口腔、肠道消化液、呼吸道粘膜以及初乳中,部分反流入血。我们前期研究探讨了SIgA在IgAN中的作用,发现IgAN患者血清和尿液中的SIgA水平与临床表现、肾脏损伤相关;约1/3患者肾组织中有SIgA的沉积,且IgAN患者的SIgA具有致病性,可致使HRMC增殖、活化从而参与肾脏的损伤。近年来的研究结果提示,与粘膜免疫相关的Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)尤其是TLR4可能参与了IgAN的发病。TLRs是参与固有免疫的一类重要蛋白分子,在粘膜组织识别微生物和触发抗感染免疫反应的过程中发挥着至关重要的作用。IgAN患者外周血单个核细胞TLR4的表达及其m RNA转录水平均明显升高,且与患者血尿及尿蛋白密切相关;IgAN患者腭扁桃体及肾组织中TLR4高表达且与患者IgA1含量及其糖基化缺失相关,其可能通过促进促炎症细胞因子产生,从而参与系膜细胞的损伤;羟氯喹通过降低TLR4的表达,可有效降低IgAN患者的蛋白尿。因此我们从粘膜免疫新角度对IgAN发病机制进行探讨是非常必要的。研究目的:探讨SIgA和TLR4之间能否相互作用,从而介导IgAN患者肾脏的损伤。研究方法:选取我院肾内科在2016年09月-2017年09月期间住院患者,经肾脏病理活检确诊为原发性IgAN,共87例。所有病例的穿刺肾小球数≥10个,均除外糖尿病、系统性红斑狼疮、抗GBM病、慢性肝病等引起继发性IgAN。(1)免疫荧光的方法检测IgAN患者肾组织切片中SIgA的沉积情况;(2)免疫组化的方法检测SIgA沉积阳性和阴性的IgAN患者肾组织切片中TLR4,My D88和NF-κB的表达差异;(3)收集SIgA沉积阳性的IgAN患者唾液和年龄性别相匹配的健康志愿者唾液,亲和层析技术从唾液中提纯分泌型IgA,分别为P-SIgA和N-SIgA;(4)结合实验:体外培养人肾系膜细胞(Human renal mesangial cell,HRMC),流式细胞术检测SIgA和HRMC的结合情况;(5)刺激实验:并分别用400μg/ml的P-SIgA、N-SIgA和PBS(阴性对照)刺激HRMC 24h,收集细胞上清,提取细胞蛋白和总RNA,通过Western blot、ELISA和RT-PCR方法检测HRMC中TLR4、My D88、NF-κB和炎症因子TNF-α、IL-6和MCP-1的表达和分泌。研究结果:1.约30%的IgAN患者肾组织中肾小球系膜区有SIgA的沉积;2.流式细胞术结果显示:P-SIgA与HRMC结合率约85%,显著高于N-SIgA与HRMC的结合率;3.P-SIgA刺激后的HRMC,在蛋白和基因表达水平TLR4、My D88、NF-κB和炎症因子TNF-α、IL-6和MCP-1高于N-SIgA组;4.SIgA沉积阳性的IgAN患者肾组织中TLR4、My D88和NF-κB以及细胞因子TNF-α、IL-6和MCP-1的表达均明显强于正常对照组和MCD疾病对照组。研究结论:SIgA可能通过与HRMC结合沉积于系膜区,从而诱导HRMC高表达TLR4,进一步激活下游信号通路,导致炎症因子TNF-α、IL-6和MCP-1的产生,进一步导致IgAN的肾脏损伤。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R692.31
【部分图文】：

第三章 结果3.1 肾小球 SIgA 沉积检测经过肾组织的 SIgA 免疫荧光检测发现：红色为 IgA 的 SC 分泌片段，表达在系膜区，少量的在肾小管表达，绿色的 IgA 均沿系膜区分布。共检测了 87 名IgAN 患者，其中 28 名可见到系膜区 SC 与 IgA 的共沉淀，既 SIgA，显色为黄色，占 31%（图 3.1）。阴性对照只见 IgA 沿系膜区分布，未见红色 SC 的沉积。

图 3.2 通路蛋白 TLR4、MyD88 和 NF-κB 在肾组织的沉积（A,B）：TLR4 分别在正常人、SIgA 沉积阳性 IgAN 患者肾脏的表达；（C,D）：MyD88分别在正常人、SIgA 沉积阳性 IgAN 患者肾脏的表达；（E,F）：NF-κB 分别在正常人、SIgA沉积阳性 IgAN 患者肾脏的表达。放大倍数：400×3.3 唾液 SIgA 的提纯结果经过 Jacalin 层析柱提纯后，其中：A 峰为穿过峰，为未与 Jacalin 结合的蛋白；B 峰为洗脱峰，既经蜜二糖洗脱下来的 SIgA（图 3.3）。

图 3.3 唾液 SIgA 的 Jacalin 亲和柱色谱图3.4 提纯 SIgA 的鉴定结果不论从 IgAN 患者还是志愿者唾液经 Jacalin 纯化的 SIgA，经过 SDS-蛋白泳分为 3 个条带：SC（75kDa）、IgA 重链（56kDa）和 IgA 轻链（23kDa）同商品化 SIgA 位置基本一致，且无杂带（图 3.2A）；经 Western blot 检测更一步验证了 SC（图 3.4 B）和 IgA（图 3.4 C）。

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