抑制坏死性凋亡对单侧输尿管结扎肾脏保护作用的初步研究

发布时间：2020-09-19 18:04

　　 目的:肾间质炎症纤维化是多种慢性肾病进展为终末期肾病的共同病变过程和病理基础,其发病机制迄今尚未阐明,通常认为是多因素综合作用的结果,其中细胞死亡对炎症反应及后续纤维化发挥关键作用。坏死性凋亡是一种新型的细胞死亡模式,它具有细胞质膜崩解、细胞器肿胀和线粒体功能丧失等细胞坏死的主要特征,同时又是一种可调控的,caspase非依赖的程序性细胞死亡。大量研究显示坏死性凋亡能诱发、驱动炎症反应。坏死性凋亡在急性胰腺炎、缺血性损伤、神经退行性变等小鼠模型,以及临床克罗恩病中发挥重要作用。此外,坏死性凋亡在多种肾脏疾病,如顺铂诱导的肾损伤、肾缺血再灌注、肾移植以及肾大部切除大鼠慢性肾纤维化等多种动物模型中也起到关键作用。在本研究中,我们应用单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)建立肾间质炎症纤维化模型,检测小鼠UUO模型中是否存在坏死性凋亡,然后应用坏死性凋亡特异性抑制剂necrostatins-1(Nec-1)进行干预,检测梗阻肾脏中炎症和纤维化分子指标表达情况,旨在探讨抑制坏死性凋亡的肾脏保护作用及可能机制,为临床肾病的治疗提供新思路。方法:1.动物模型建立健康雄性C57BL/6J小鼠按随机区间法分为假手术组(Sham,n=6)、左侧输尿管结扎组(UUO,n=6)、输尿管结扎后经Nec-1治疗组(UUO+Nec-1,n=6)。UUO+Nec-1组自手术日起,每天给予Nec-1(1mg/kg/day)腹腔注射治疗。Sham组除不结扎输尿管外同模型组做相同处理。2.肾组织取材和指标检测术后7天处死小鼠,留取肾组织于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常规病理学染色、免疫组织化学检测;剩余肾组织经液氮速冻,用于提取肾皮质总蛋白和总RNA。免疫组织化学和Western blot检测受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)、受体相互作用蛋白3(receptorinteracting protein 3,RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-lβ(Interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α型肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原(collagen I,Col 1)的蛋白表达,荧光实时定量PCR检测RIP1、RIP3、MLKL、TNF-α、IL-1β、MCP-1、TGF-β1、α-SMA、Col 1的基因表达。结果:1.Nec-1改善了UUO引起的肾脏病理损伤HE染色显示,Sham组肾小管结构正常,肾间质未见明显炎细胞增生。UUO组可见单核与淋巴细胞浸润明显,部分近曲小管水肿或萎缩,部分肾小管明显扩张,管腔内可见坏死脱落的上皮细胞。Nec-1治疗后肾间质炎性浸润减少,肾小管上皮细胞肿胀、扩张和坏死程度减轻。Masson染色显示,UUO组肾间质有大量胶原纤维沉积,Nec-1治疗明显减轻了纤维化程度。2.Nec-1降低了UUO引起的坏死性凋亡相关标志物表达的升高免疫组织化学检测结果显示,Sham组RIP1在远曲小管胞浆中有少量表达,RIP3和MLKL在小管胞浆中有微量表达。UUO组RIP1在大量远曲小管上皮细胞胞浆和胞核中都有表达,RIP3多于近曲小管胞浆中呈强阳性,而MLKL在部分小管细胞胞浆中大量表达,部分小管胞核也有表达。Nec-1干预后,RIP1、RIP3和MLKL的阳性信号均明显减弱。Western blot和荧光实时定量PCR检测结果显示,UUO肾组织中RIP1、RIP3、MLKL蛋白及mRNA表达较Sham组显著升高,给予Nec-1治疗后,RIP1、RIP3、MLKL蛋白质和mRNA水平明显降低。3.Nec-1减少了UUO小鼠肾脏中炎症因子的表达免疫组织化学结果显示,Sham组炎症相关因子IL-1β、MCP-1于肾小管胞质中有少量表达,UUO组肾小管胞质中二者表达显著上调,UUO+Nec-1组IL-1β和MCP-1在肾小管中的阳性表达明显降低。Western blot和荧光实时定量PCR检测结果显示,UUO组肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1蛋白质及mRAN表达相较Sham组明显上升,给予Nec-1治疗后,三种炎症因子的蛋白质及mRAN水平显著下调。4.Nec-1减轻了UUO小鼠肾脏间质纤维化程度免疫组织化学检测显示,在Sham组肾间质中,Col 1、TGF-β1有微量表达,α-SMA仅表达于动脉中层平滑肌细胞中。UUO组,Col 1在间质内表达量显著增加,α-SMA除表达于血管平滑肌外,还大量表达于肾间质和肾小管上皮细胞中,TGF-β1在肾小管胞浆中大量表达。UUO+Nec-1组Col 1、α-SMA和TGF-β1的阳性表达明显减弱。Western blot和Real-time PCR检测结果显示,UUO组肾组织中Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA水平均较Sham组显著升高,应用Nec-1治疗后,Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA表达量明显下降。结论:1.坏死性凋亡在单侧输尿管结扎肾脏病理改变中起重要作用。2.坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1的肾脏保护作用可能是部分通过抑制炎症和纤维化实现的。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

21图 1 肾组织 HE 染色Fig. 1 HE staining of renal tissue (×400)am group B: UUO group C: UUO+Nec-1

图 2 肾组织 Masson 染色Fig. 2 Masson staining of renal tissue (×400)A: Sham group. B: UUO group. C: UUO+Nec-1 group. D: Statistical analysisfor the percentage of renal fibrotic area.**P<0.01 vs. Sham group,##P<0.01 vs.UUO group.

23 3 各组小鼠肾组织 RIP1 免疫组化染色结nohistochemical staining for RIP1 in renal am group B: UUO group C: UUO+Nec-

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本文编号：2822837