前列腺癌细胞中TNK1的信号调控功能研究

发布时间：2020-09-21 14:32

　　前列腺癌的发病率在全球居于第四位,在男性中居于第二位,是男性当中最为常见的恶性肿瘤。2018年,前列腺癌在全球和中国的死亡例数分别为35.9万和2.3万,转移是造成前列腺癌患者死亡的主要原因。目前,前列腺癌的治疗手段十分有限,且副作用大,病人会对有些治疗方式产生抗性,因此,深入研究前列腺癌发生、发展和转移的分子机制,为其临床治疗提供新的药物靶点,在理论和临床上具有重要意义。酪氨酸激酶分为受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶两大类,在调节正常细胞的生长、增殖、分化和存活等过程中具重要作用。酪氨酸激酶及其下游信号通路PI3K/Akt、MAPK、JAK/STAT的异常激活与肿瘤的发生、发展和转移密切相关,是肿瘤靶向治疗的研发热点领域。TNK1是近年发现的具有促癌活性的非受体酪氨酸激酶之一。研究表明,TNK1与肿瘤的发生相关,其在人源肿瘤样本中的表达水平升高,对肿瘤细胞中的PI3K/Akt和JAK/STAT通路具有调节作用,可以促进肿瘤细胞的生长和存活,并抑制肿瘤细胞的凋亡。但这些研究仅限于对现象的观察,并未对TNK1的激活机制及其下游靶分子进行具体的分析,本论文对此进行了初步的探讨。免疫印迹实验表明,TNK1表达于人前列腺癌细胞系PC-3、DU145、LNCaP中,在人前列腺癌组织中,TNK1的表达明显高于癌旁组织,提示TNK1在前列腺癌的发生和发展中可能具有重要的作用。为进一步研究TNK1在前列腺癌细胞中的功能,本论文利用CRISPR/Cas技术构建了TNK1表达缺失的人前列腺癌细胞系。对三段sgRNA序列的初步筛选结果显示,靶向TNK1激酶编码区的sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率优于靶向N-端外显子的sgRNA1,表现为前二者能够更有效地下调TNK1的表达。基于此,本文将含sgRNA2或sgRNA3的质粒转入PC-3细胞,筛选G418抗性细胞克隆,每段序列筛选48个克隆,分别编号为2CX和3CX(X=1-48)。免疫印迹实验结果显示,sgRNA2或sgRNA3的基因编辑效率相同,均可使25%的细胞克隆不表达TNK1。从部分TNK1表达缺失的细胞克隆中提取基因组DNA,进行PCR,并对PCR产物进行测序,发现TNK1表达缺失是由于非同框移码突变造成。本文从中选取具有不同移码突变的细胞克隆2C29和2C40进行后续实验。克隆形成实验表明,TNK1缺失对PC-3细胞克隆形成的数目无明显影响,但显著减少了克隆的平均面积,提示TNK1缺失抑制细胞增殖,但不影响细胞的密度依赖性生长。Transwell迁移实验显示,TNK1缺失显著抑制细胞迁移,且明显改变迁移细胞的形态,抑制迁移细胞在膜上的铺展。此外,TNK1缺失下调间充质细胞标记分子vimentin和N-cadherin的表达,说明TNK1缺失抑制肿瘤细胞的EMT过程。对PC-3细胞中信号通路的分析表明,TNK1缺失显著抑制STAT3活性位点Y705的磷酸化,但对Akt和ERK1/2的磷酸化无明显影响,提示TNK1通过JAK/STAT信号通路调节PC-3的细胞应答。综上,本论文首次发现非受体酪氨酸激酶TNK1可通过磷酸化STAT3的活性位点Y705而促进PC-3细胞的增殖、迁移和EMT,揭示了TNK1调节肿瘤细胞应答的新机制,为前列腺癌的临床治疗提供了新靶标和新思路。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.25
【部分图文】：

结构示意图,受体,配体,激酶结构域

华中科技大学硕士学位论文异较大（决定了各受体的特异性），TKD的结构则较为保守。PDGFR、VEGFR、FGFR、Ret和STYK1的TKD在结构上不连续，由两个肽段组成，称为分裂激酶结构域(SpKinase Domain)（图1.1）[16]。大部分RTKs的配体为可溶性生长因子，但Eph(ephrin)受体家族的配体为邻近细胞表面的膜结合蛋白ephrin，discoidin受体(DDR)的配体为胶原纤维。

结构示意图,酪氨酸激酶,磷酸化

1.2. NRTKs分类与结构示意图。 NRTKs分为10个亚家族，由酪氨酸激酶区和2-4个组成，各结构域的标注见图下方（http://www.cellbiol.net/ste/bookimages.php）。肿瘤细胞中的主要酪氨酸激酶信号通路TKs与NRTKs的激活方式不同。对于RTKs而言，配体结合诱导其形成二聚单体的酪氨酸激酶区均可使另一单体的酪氨酸残基发生磷酸化，即交叉磷酸化，使RTKs被激活[14]。NRTKs则通过同源二聚化、与其他蛋白质相其他激酶磷酸化等不同方式被激活[15]。氨酸激酶可激活PI3K/Akt、MAPK和JAK/STAT等多种信号通路，对细胞、分化、衰老、凋亡、迁移等具有重要调节作用。由获得性突变、染色体扩增导致的RTKs异常激活[14]以及由基因突变、转位、过表达导致的NRTK15]与人类常见恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的发生、发展密切相

示意图,信号通路,示意图,磷酸化

图 1.3. PI3K/Akt 信号通路激活示意图。磷酸化 RTKs 直接或通过中介蛋白将 PI3K 招募至细胞膜内表面，PI3K 的产物 PIP3 将 Akt 募集至质膜处，Ser/Thr 酶 PDK1 与 mTORC2 磷酸化 Akt，使其激活。Akt 通过磷酸化下游信号蛋白调节细胞应答。能激活 PI3K/Akt 信号通路的 RTKs 列于图左下方的虚线方框内[14]。1.2.4 MAPK 信号通路与前列腺癌MAPK 的全称是 mitogen-activated protein kinases（丝裂原激活蛋白激酶），MAP信号通路又叫 RAS-RAF-MEK-ERK 信号通路，是由 RAF、 MEK1/2、ERK1/2 等激酶组成的一个级联信号转导通路。研究发现，RAS 有三种亚型，分别为 KRAS、HRA和 NRAS，RAS 为小 G 蛋白，与 GDP 结合时无活性，GTP 结合使其转变成活性形式。RAF 有三种组织特异性亚型即 A-RAF、B-RAF 和 C-RAF/RAF-1，又叫 MAPKK(MAP kinase kinase kinase, MAPKKK)，可磷酸化 MEK1/2 (MAP kinase kinase, 又叫MAPKK)，MEK1/2 可磷酸化 ERK1/2 (Mitogen-Activated Protein Kinases, 又叫

【相似文献】