生松素对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响及其机制研究

发布时间：2020-09-29 14:34

　　 目的:研究生松素(pinocembrin,Pb)对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响,并探讨其作用机制,为糖尿病肾病(diabetic nephropath,DN)的防治提供新思路。方法:(1)高糖最佳作用时间的筛选:体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),予以30 mmol/L葡萄糖干预不同时间(0小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时),采用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌水平;(2)生松素的抗炎作用及机制:将NRK-52E细胞培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM中,将细胞随机分为正常对照(normal control,NC)组、甘露醇(m annitol,MA)组、高糖(high glucose,HG)组、HG+DMSO组、HG+Pb30组、HG+Pb60组(预试验筛选出Pb的低剂量干预浓度为30 umol/L,高剂量干预浓度为60 umol/L)、HG+Val组:采用免疫荧光法检测细胞内p-P38MAPK表达水平,采用Western-blot检测细胞内P38MAPK、p-P38MAPK、NF-κB、p-NF-κB、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK水平,ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平,采用qPCR法检测细胞内T NF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平。(3)P38MAPK激动剂茴香霉素(Aniso mycin,AM)逆转Pb的抗炎作用,明确Pb的抗炎作用是否是依赖P38M APK通路:将NRK-52E细胞随机分为NC组、HG组、HG+AM组、HG+Pb30组、HG+Pb30+AM组;采用Western-blot检测细胞内P38MAPK、pP38MAPK水平,采用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平。结果:1.高糖诱导细胞合成和分泌炎症因子最佳作用时间筛选:随着高糖干预时间的延长,细胞内TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平随之升高,与0小时相比,TNF-α、IL-6在48小时达到高峰(P0.05),IL-1β在72小时达到高峰(P0.05),最终确定48小时为最终刺激时间。2.生松素抑制H G诱导的NRK-52E细胞合成和分泌炎症因子:ELISA结果显示,在蛋白质水平,与NC组相比,HG组IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显升高(P0.05);而HG+Pb30、HG+Pb60组IL-6、TNF-α、IL-1β水平均较HG组明显降低(P0.05)。qPCR结果显示,在转录水平,与NC组比较,HG组细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平明显升高(P0.05);而HG+Pb30、HG+Pb60组细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平较HG组均明显下降(P0.05)。3.生松素抑制HG诱导的NRK-52E细胞MAPK信号通路的激活:(1)在蛋白质水平,免疫荧光结果显示,HG组的绿色荧光(p-P38M APK)较NC组明显增强,而HG+Pb30、HG+Pb60组的绿色荧光均较HG组明显减弱;Western blot结果显示,与NC组相比,HG组p-P38MAPK/P38MAPK水平明显升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60组p-P38MA PK/P38MAPK水平均较HG组明显降低(P0.05)。(2)Western blot结果显示,与NC组相比,HG组p-JNK/JNK水平明显升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60组p-JNK/JNK较HG组表达水平差异无统计学意义(P0.05)。(3)Western blot结果显示,与NC组相比,HG组p-ERK/ERK水平明显升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60组p-ERK/ERK较HG组表达水平差异无统计学意义(P0.05)。4.生松素抑制高糖诱导的NRK-52E细胞NF-κB激活:Western blot结果显示,与NC组相比,H G组p-NF-κB/NF-κB水平明显升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60组p-NF-κB/NF-κB水平均较HG组明显降低(P0.05)。5.AM逆转生松素对高糖诱导的NRK-52E细胞P38MAPK表达的抑制作用:Western blot结果显示,在蛋白质水平,与NC组相比,HG组、HG+AM组p-P38MAP K/P38MAPK水平明显升高(P0.05),与HG组相比,HG+AM组p-P38MAPK/P38MAPK水平进一步升高(P0.05),HG+Pb30组p-P38MAPK/P38MAPK水平明显降低(P0.05),而HG+Pb30+AM组细胞内p-P38M APK/P38MAPK水平较HG组比较差异无统计学意义(P0.05)。6.AM逆转生松素对高糖诱导的NRK-52E细胞炎症因子的抑制作用:ELISA结果显示,在蛋白质水平,与NC相比,HG组、HG+AM组IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显升高(P0.05),与HG组相比,HG+AM组IL-6、TNF-α、IL-1β水平进一步升高(P0.05),HG+Pb30组IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显降低(P0.05),而HG+Pb30+AM组细胞培养上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平较HG组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.Pb可抑制HG诱导的肾小管上皮细胞炎症因子的表达。2.Pb通过抑制P38MA PK信号通路的激活而抑制HG诱导的肾小管上皮细胞炎症因子的表达。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R692.9
【部分图文】：

图 1-1 ELISA 法检测细胞培养上清液Figure 1-1 ELISA detected the level of IL-6、*代表与 0h 比较 P<0.05。Pb 对 HG 诱导的 NRK-52E 细胞合成ELISA 结果显示，在蛋白质水平液中 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平明显b60、HG+Val 组细胞培养上清液中显降低（P<0.05）（见表 2-1，图 2与正常组比较，HG 组细胞内 IL-6、（P<0.05）； 而 HG+Pb30、HG+P

Table 2-1 ELISA detected the level of IL-6、TNF-α、IL-1β in the supernata组别 样本数 IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-1β（pg/mL）NC 组 3 14.778±1.957 23.146±1.518 21.298±2.233MA 组 3 15.644±0.945 22.753±2.482 21.396±1.254HG 组 3 45.446±3.055* 62.415±3.455* 43.786±2.419*HG+DMSO 组 3 46.252±2.041* 62.608±1.953* 44.260±2.742*HG+Pb30 组 3 34.152±1.590# 43.483±2.975# 32.567±1.872#HG+Pb60 组 3 34.129±2.030# 42.195±2.991# 30.728±2.143#HG+val组 3 22.244±2.119# 34.899±4.297# 25.801±2.020#注：*代表与 NC 组比较 P<0.05，#代表与 HG 组比较 P<0.05。

qPCR检测IL-6、TFigure2-2qPCRdetectedthem

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本文编号：2829851