CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究

发布时间：2020-09-30 00:06

　　目的目前,不孕不育症是影响人类健康的一种常见的疾病,约15%的育龄人员有不孕不育疾病的问题,在这里约百分之五十是因为男性原因,在医学中被称之为男性不育。然而,在临床就诊的男性不育症患者中,无精子症患者的治疗最为棘手。根据患者有无输精管梗阻的表现,临床上将无精症分为梗阻性无精症(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性无精症(non-obstructive azoospermia,NOA)两种,其中NOA患者睾丸生精功能严重障碍,多次精液常规检查报告提示镜下见极少量精子或没有精子。NOA患者的睾丸组织病理表型有睾丸生精小管结构紊乱、生精细胞成熟阻滞、生精细胞减数分裂停滞、睾丸生精功能低下等。尽管辅助生殖技术已经帮助很多不育夫妇成功受孕,然而很多NOA患者仍然无法生育自己遗传学上的后代。近年来,关于引起NOA相关的基因突变或多态性现象逐渐成为男性不育症研究的的热点。因此,针对NOA患者精子发生过程中的相关分子生物学机制的深入研究,不仅有助于逐步了解NOA的发病原因,对于男性不育症靶控治疗的发展和辅助生殖技术均有着非常重要的理论指导及应用价值。CD82是近些年在肿瘤领域研究较多的转移抑制基因之一,它属于四穿膜超家族(Transmernbrance 4 superfamily,TM4SF)的成员,其结构为细胞膜糖蛋白,主要生物学功能是对细胞间及细胞与细胞外基质的信号传导产生影响,同时参与调节细胞的增殖与分化。其参与的生物学途径有细胞周期调控、细胞骨架结构改变、蛋白激酶磷酸化调节、细胞凋亡调控、细胞粘附/迁移等。研究发现,在NOA患者睾丸的组织中CD82呈高表达。目前,关于CD82的过表达是否会引起精原细胞分化、增殖过程发生异常进而引起精子生成障碍,国内外前尚无相关的研究及文章报道。本实验首先检测部分梗阻性以及非梗阻性无精子症患者睾丸组织中CD82蛋白的表达情况,比较分析了二组标本之间存在的差异表达,通过向小鼠睾丸组织显微注射CD82转染的腺相关病毒,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,分析验证了CD82高表达对小鼠生精细胞分化增殖产生的影响,并采用高通量转录组测序的方法对CD82可能引起生精障碍的分子生物学途径进行探讨,为进一步寻找CD82在生精细胞分化过程中相关的分子机制提供理论基础。方法1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织中生精细胞不同的形态学表现,免疫组化观察CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中的表达情况。2.采用Western blot进行定量检测CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中差异表达。3.包装表达CD82的腺相关病毒(AVV),显微注射法感染小鼠睾丸组织,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,免疫荧光观察AVV感染效率。4.HE染色观察CD82高表达对小鼠睾丸组织精子发生的影响。5.转录组测序检测CD82高表达小鼠睾丸实验组和对照组之间的差异表达基因。6.随机挑选6个差异表达基因,Q-RTPCR验证高通量转录组测序结果的可靠性。结果1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织存在不同形态学改变,其中5例患者生精功能正常,表现为曲细精管密度正常,管腔基底部各级生精细胞存在,管腔内可见成熟精子形成,符合梗阻性无精子症患者病理改变;8例患者生精功能障碍,表现为曲细精管稀疏,管腔基地部各级生精细胞数量减少,厚度变薄,管腔内极少有成熟精子形成,符合非梗阻性无精子症睾丸病理改变。2.免疫组化结果显示,梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织内间质细胞和支持细胞均可见CD82阳性表达,非梗阻性无精子症患CD82表达更为显著,采用Western blot法进行定量检测,结果显示在二组睾丸标本中CD82蛋白的表达差异具有统计学意义(P值0.05)。3.CD82成功插入腺相关病毒AVV载体,显微注射法成功感染小鼠睾丸组织,1周后免疫荧光显示小鼠睾丸组织外源性CD82表达明显,CD82高表达小鼠睾丸组织模型构建满意。4.C57小鼠(8周龄)睾丸组织的HE染色结果显示,对照组小鼠睾丸组织的生精功能正常,各级生精细胞生长活跃,曲细精管内可见到部分成熟精子,实验组小鼠睾丸组织呈现生精功能异常,各级生精细胞数量减少,管壁变薄,无成熟精子或仅极少量长形精子形成。5.转录组测序结果显示,与对照组相比,CD82高表达组差异表达基因数590个,其中上调基因289个,下调基因301个,主要参与的生物过程包括有细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,其中细胞周期调控、转录调节相关基因所占比例较大。6.随机挑选的6个差异基因,各选三份组织样本进行Q-RTPCR验证,分析结果提示基因表达变化水平与高通量转录组测序结果趋势一致,转录组测序结果可靠。结论:1.在OA和NOA患者睾丸组织中,CD82检测结果均呈阳性表达,NOA患者睾丸组中CD82表达更为显著,定量检测法(Western blot)检测两组标本组织的CD82蛋白差异表达有统计学意义2.在高表达CD82小鼠睾丸组织中,曲细精管基底室生殖细胞结构尚清晰,近腔室内生殖细胞减少,极少量精子形成,生殖细胞分化停滞在精原细胞及初级精母细胞早期,预示CD82过表达可能会引起精原细胞分化、有丝分裂-增殖过程发生异常。3.高通量转录组测序显示高表达CD82时差异基因所参与的生物学过程和信号通路涉及细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,细胞周期调控和转录调节可能是CD82在精子发生障碍过程中的重要调控环节。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R698.2
【部分图文】：

病理类型,生殖细胞

图 1 NOA 病理类型（Stukenborg JB and Kjartansdóttir KR，2014）a)正常的精子出现；(b)生殖细胞减数分裂暂停，不能完整进行；(c)生殖细胞减数分不能完成；(d)唯支持细胞综合症。左图表现的是: 无疾病的成年睾丸生精小管表细胞种类(不一样颜色代码进行区分)，包含在生殖细胞以及体细胞间的细胞。右精子生成过程中出现障碍的曲细精管表现图及对应的组织样本的免疫学染色图片。Fig.1 NOA is divided into the following types：(a) the appearance of normal sperm; (b) the meiosis of germ cells is suspended and canleted; (c) suspension before meiosis of germ cells， which cannot be completed; (d

模式图,睾丸,附睾,模式图

图 2 睾丸-附睾解剖模式图(Cooke HJ and Saunders PT，2002)(a)睾丸白膜为一层坚厚的纤维膜，沿睾丸后缘白膜逐渐增厚，凸入睾丸内形成睾丸纵隔由发出许多结缔组织小隔，将睾丸实质分隔成诸多睾丸小叶。睾丸小叶内含有迂曲细精管。(b)睾丸横切图展示了不同分化阶段的生精细胞(绿色)嵌在支持细胞(Sertoli分化发育，间质细胞(Leydig cell，LC) 具有睾酮分泌功能，分布在管外，而逐级成熟管腔中央部分。管周肌样细胞（Peritubularmyoidcell，PTM）。Fig.2 Anatomy model of testicular - epididymiste :(a) the tunica albuginea of the testis is a thick fibrous membrane， which gradually thicng the posterior margin of the testis and protrudes into the testis to form the mediastinum otis. Many connective tissue septum from the mediastinum， dividing the parenchyma of the o numerous lobules. Testicular lobule contains a tortuous circumflex spines. (b) testinsection showed the differentiation and development of spermatogenic cells (green) at diffferentiation stages embedded in Sertoli cell， and Leydig cell had the function of testosteretion， distributed outside the tube，while the progressively mature sperm was in the centrathe tube cavity. PTM，perituzummyoid cell .

支持细胞,生殖细胞

期循环方式进行的。整个精子发生(spermatogenesis)是在睾丸组织的miniferoustubule，又称生精小管)中完成。曲细精管主要由三类细胞组胞( peritubularmyoid cell，PTM)、支持细胞(sertoli cell)和生殖细胞(ger样细胞位于生精小管的上皮外基膜，能协助管内精子及液体的排出胞与支持细胞共同构成成曲细精管的基底膜部分[26,27]。支持细胞能细胞提供营养支持，传递外部信号，同时分泌生精细胞增殖-分化不的诸多细胞因子。支持细胞在曲细精管的最低端延伸到上皮的全层发育一直到变成成熟精子的全部生理、形态改变过程也都沿着支持行。它的排列顺序为：紧贴曲细精管的基底膜的单倍体精原细胞位次分别为精原、初级精母、次级精母、精子、分化的精子，成熟的细精管的管腔内[22]。(图 3 )。

【参考文献】