CREB在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用

发布时间：2017-04-02 21:10

  本文关键词：CREB在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是亮氨酸拉链(leucine-zipper)转录因子家族中成员之一。CREB可通过其肽链中第133位丝氨酸的磷酸化募集共激活因子,调控基因转录,其靶基因参与多种细胞活动,包括肿瘤的发生、进展和代谢等。有文献报道,CREB可在多种肿瘤如急性白血病、乳腺癌、非小细胞肺癌中过表达和过度活化,并参与肿瘤的增殖与恶化过程。相反,在不同的肿瘤细胞系中下调CREB的水平可抑制细胞增殖和并诱导凋亡,提示CREB在肿瘤的增殖及凋亡抵抗中起重要作用。而CREB在前列腺癌细胞增殖与凋亡抵抗中的作用尚未见报道。CREB需经第133位丝氨酸磷酸化为磷酸化CREB(p-CREB)才能发挥促转录激活的作用,而胞内CREB的磷酸化及活化需要胞外信号的刺激诱导,目前已知的可参与CREB磷酸化活化的胞外信号有激素、突触兴奋性水平改变、生长因子、应激及炎症因子等。而在肿瘤微环境中,炎症反应与肿瘤的持续生长密切相关,而其中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的作用越来越被人们重视。TAM可通过促进肿瘤新生血管产生、新生淋巴管生成、免疫抑制、促进肿瘤迁移和侵袭等途径参与肿瘤的发生发展。然而,其相关机制尚不十分清楚,而TAM能否作为前列腺癌细胞的胞外刺激信号通过CREB通路参与肿瘤进展过程也未见报道。鉴于CREB在其他肿瘤组织中的作用及TAM作为肿瘤微环境的一部分在肿瘤进展中的重要性,本研究旨在观察creb在不同前列腺癌组织中的表达及其相关性分析,并探讨静息条件下creb在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用,及tam能否通过上调creb发挥其促进前列腺癌进展的作用。本研究由以下三部分实验组成:实验一:研究creb及p-creb在前列腺癌组织及不同前列腺细胞系中的表达及可能的功能本实验第一小部分采用组织芯片免疫组化染色技术,检测正常前列腺组织、前列腺增生组织及不同病理分期分级的前列腺癌组织中的creb及p-creb的表达,并初步分析creb及p-creb的表达阳性率、表达强度与前列腺组织恶性程度的相关性。结果显示creb及p-creb蛋白水平在前列腺癌组织中表达明显高于正常前列腺、前列腺增生组织,且随前列腺癌分级越高,阳性率越高。结果提示,随前列腺组织增殖能力增强,creb及p-creb的表达也升高,creb及p-creb的阳性率及表达强度与前列腺组织恶性程度呈现正相关关系。本实验第二小部分采用免疫细胞化学染色及westernblottingting技术,检测体外培养的前列腺基质细胞及癌细胞中creb及p-creb的表达。结果显示,与人正常前列腺基质永生化细胞系wpmy-1相比,前列腺癌细胞系pc3及lncap中creb及p-creb的表达水平的明显升高,结果提示creb及p-creb表达水平高低与前列腺细胞的增殖水平或凋亡抵抗可能存在正相关关系。实验二:研究creb在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用本实验通过ncbi数据库检索到creb基因的mrna序列,利用vectornti11.0软件设计引物。以前列腺癌细胞系lncap的mrna为模板,采用反转录pcr技术生成cdna文库,并进一步克隆creb基因的编码区,鉴定其序列的正确性,表达于重组质粒pcdna3.1-creb中。进一步转染pcdna3.1-creb于前列腺癌细胞系pc3及lncap中,观察其对增殖及凋亡的作用。结果显示,转染重组质粒pcdna3.1-creb后,pc3及lncap细胞中的creb及p-creb含量上升,说明重组质粒的成功构建与表达;同时观察到增殖相关分子pcna显示出相似的表达模式,利用cck-8试剂盒检测细胞增殖水平,也表明creb及p-creb含量水平与前列腺癌细胞增殖水平正相关。另外,tunel染色结果进一步显示转染重组质粒pcdna3.1-creb可抑制前列腺癌细胞凋亡,可能与凋亡抑制蛋白survivin的表达升高有关。相反,采用sirna技术沉默creb,可降低前列腺癌细胞增殖,并促进其细胞凋亡。实验三:研究CREB在TAM相关的前列腺癌细胞生长中的作用本实验通过体外采用佛波酯(PMA)诱导血液单核细胞系THP-1成为巨噬细胞,再通过LPS+IFN-γ联合刺激使巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞,通过IL-4刺激诱导巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞,分别收集其条件性培养基(conditioned medium)M1-CM和M2-CM。再用两者分别刺激LNCap和PC3细胞,观察其对前列腺癌细胞生长的影响,并探讨CREB在其中的作用。CCK-8检测结果显示,M2型巨噬细胞条件性培养基可促进前列腺癌细胞LNCap及PC3的生长,同时有CREB上调,而M1型巨噬细胞条件性培养基刺激时无显著变化。而CREB-siRNA可抑制M2-CM促进前列腺癌细胞生长的作用,提示CREB参与M2型巨噬细胞促进前列腺癌进展的作用。而M2型巨噬细胞通过分泌什么胞外因子诱导前列腺癌细胞CREB上调的机制有待进一步研究。
【关键词】：CREB p-CREB 前列腺癌 增殖 凋亡 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-16
• 文献回顾16-32
• 第一部分 CREB及p-CREB在前列腺癌组织及不同前列腺细胞系中的表达及可能的功能32-52
• 1 材料32-36
• 1.1 组织芯片32
• 1.2 细胞系32
• 1.3 相关试剂32-33
• 1.4 缓冲液33-35
• 1.5 相关仪器35-36
• 2 方法36-39
• 2.1 不同前列腺组织芯片免疫组化染色36
• 2.2 人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1、前列腺癌细胞PC3及LNCap的培养36-37
• 2.3 三种不同细胞系的免疫细胞化学染色37-38
• 2.4 Western blotting检测三种不同细胞系的增殖水平（PCNA表达水平）38-39
• 2.5 统计学分析39
• 3 结果39-50
• 3.1 CREB在不同前列腺组织中的表达情况39-42
• 3.2 p-CREB在不同前列腺组织中的表达情况42-48
• 3.3 CREB在不同前列腺细胞中的表达情况48-49
• 3.4 p-CREB在不同前列腺细胞中的表达情况49
• 3.5 Western blotting检测CREB及p-CREB在WPMY-1、PC3及LNCap细胞中的表达49-50
• 4 讨论50-52
• 第二部分 CREB在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用52-71
• 1 材料52-54
• 1.1 感受态菌株52
• 1.2 细胞系52
• 1.3 相关试剂52-53
• 1.4 培养基（液）及缓冲液53
• 1.5 相关仪器53-54
• 2 方法54-61
• 2.1 E.coli JM109感受态的制备54
• 2.2 LNCap细胞的总RNA提取54
• 2.3 反转录合成cDNA54-55
• 2.4 PCR扩增CREB基因编码区55
• 2.5 产物琼脂糖凝胶电泳分离及胶回收55-56
• 2.6 将DNA回收产物和pcDNA3.1 质粒连接重组56-57
• 2.7 重组质粒pcDNA3.1-CREB的扩增和鉴定57
• 2.8 重组质粒pcDNA3.1-CREB的转染57-58
• 2.9 转染CREB-siRNA58
• 2.10 检测CREB转染效率58-59
• 2.11 CCK-8 试剂盒检测细胞增殖水平59
• 2.12 TUNEL染色检测细胞凋亡59-60
• 2.13 统计学分析60-61
• 3 结果61-69
• 3.1 重组质粒pcDNA3.1-CREB的鉴定结果61-63
• 3.2 转染重组质粒pcDNA3.1-CREB对前列腺癌细胞增殖水平的影响63-66
• 3.3 转染CREB-siRNA对前列腺癌细胞增殖水平的影响66-67
• 3.4 转染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA对前列腺癌细胞凋亡的影响67-68
• 3.5 转染pcDNA3.1-CREB及CREB-siRNA影响前列腺癌细胞凋亡的可能机制68-69
• 4 讨论69-71
• 第三部分 CREB在TAM相关的前列腺癌细胞生长中的作用71-80
• 1 材料71-72
• 1.1 细胞系71
• 1.2 相关试剂71-72
• 1.3 相关仪器72
• 2 方法72-74
• 2.1 血液单核细胞系THP-1 的培养及其巨噬细胞诱导72
• 2.2 诱导巨噬细胞向M1及M2型分化72-73
• 2.3 收集M1及M2型巨噬细胞条件性培养基73
• 2.4 M1及M2型巨噬细胞条件性培养基刺激前列腺癌细胞73
• 2.5 Western blotting73
• 2.6 免疫细胞化学染色73-74
• 2.7 CCK-8 试剂盒检测细胞增殖水平74
• 2.8 统计学分析74
• 3 结果74-79
• 3.1 鉴定血液单核细胞系THP-1 向巨噬细胞的诱导74-75
• 3.2 鉴定巨噬细胞向M1及M2表型诱导75-76
• 3.3 M2型巨噬细胞条件性培养基对前列腺癌细胞生长的影响76-77
• 3.4 CREB在M2型巨噬细胞条件性培养基促进前列腺癌细胞生长中的作用77-79
• 4 讨论79-80
• 小结80-81
• 参考文献81-93
• 个人简历和研究成果93-94
• 致谢94

  本文关键词：CREB在前列腺癌细胞增殖与凋亡中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：283150