ILEI在TGF-β诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用机制研究

发布时间：2020-10-10 13:56

　　 前言慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)威胁着全世界的公共健康,发病率逐年递增,且呈年轻化趋势。研究证实大部分CKD进展至肾衰竭的共同通路是肾小管-间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF),目前对RIF的发病机制尚不明确,对其发生、发展过程尚缺乏全面而深刻的认识。既往研究表明,在RIF的发生、发展过程中上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)起到了至关重要的作用。肾小管上皮间质转分化,是指当肾脏遭受到局部激活或损伤后,肾小管上皮细胞转换为间质细胞形态及特征的过程。参与EMT的调节因子有很多,其中公认的最重要的促纤维化因子是转化生长因子-beta(TGF-β)。TGF-β介导的信号传导通路错综复杂,主要包括Smad依赖性和Smad非依赖性信号通路(例如ERK/MAPK,PI3K/AKT,Rho A,JNK/p38等等)。本文研究的细胞因子FAM3C又被称为白介素样的EMT诱导因子(interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer,ILEI)是2002年新发现的细胞因子样基因家族FAM的成员,FAM家族由FAM3A、FAM3B、FAM3C和FAM3D 4个成员组成。近期研究发现ILEI参与了癌症的进展过程,以及EMT的发生。在乳腺上皮细胞发生EMT的过程中,ILEI表达及分泌明显增加。并认为ILEI是TGF-β的下游因子,沉默ILEI能减弱TGF-β促进EMT发生的作用。目前,关于ILEI与肾小管上皮细胞转分化之间关系的研究尚没有相关报道,我们以人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为体外模型,探讨ILEI在肾小管发生上皮-间质转分化时的变化以及ILEI对TGF-β诱导的肾小管上皮间质转分化的具体作用及机制。第一部分ILEI与肾小管上皮间质转分化之间的关系研究目的:观察TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化时的相关变化,探讨ILEI在肾小管上皮细胞转分化中表达的变化。方法:常规培养肾小管上皮细胞(HK-2细胞),不同剂量的TGF-β1(0、l、2、5及10ng/ml)作用于HK-2细胞48小时或5ng/ml浓度的TGF-β1作用于HK-2细胞不同时间(0、12、24、48及72小时),使用相差显微镜下观察各组HK-2细胞的形态学变化,Western blot、RT-PCR及免疫荧光检测各组HK-2细胞的ILEI、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及波形蛋白(Vimentin)的蛋白及m RNA的表达。此外应用Transwell小室法检测HK-2细胞迁移能力的变化。结果:(1)TGF-β1刺激HK-2细胞后,其细胞形态向成纤维细胞转化,细胞与细胞的间距明显增大,细胞形态变大、变梭。(2)TGF-β1以时间依赖的方式下调HK-2细胞E-cadherin的蛋白及m RNA表达,上调α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表达。(3)ILEI在HK-2细胞中有少量表达,在TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT时表达增加,且TGF-β1以时间及剂量依赖的方式上调HK-2细胞ILEI的蛋白和m RNA表达。(4)随着TGF-β1作用时间的延长,HK-2细胞的迁移能力逐渐增强。结论:(1)TGF-β1能够诱导HK-2细胞发生EMT,与E-cadherin、α-SMA及Vimentin存在时间依赖性,且TGF-β1诱导HK-2细胞后能增强细胞的迁移能力。(2)ILEI参与了肾小管上皮间质转分化,其表达水平与TGF-β1存在时间和浓度依赖性。第二部分ILEI在TGF-β诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用机制研究目的:探讨ILEI在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化过程中所发挥的作用及其机制。方法:根据基因序列设计特异引物,扩增ILEI基因片段,使用pc DNA 3.1+质粒进行ILEI表达载体的构建,使用Lipofectamine 2000试剂进行转染。ILEI质粒转染72h后,Western blot及RT-PCR检测正常组、空载体转染组、ILEI转染组E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表达,使用Transwell小室法检测各组HK-2细胞迁移能力的变化。在ILEI质粒转染24h后,给予5ng/ml TGF-β1诱导48h,相差显微镜观察细胞形态变化,Western blot及RT-PCR检测经TGF-β1诱导的正常组、空载体转染组、ILEI转染组的E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表达,使用Transwell小室法检测各组HK-2细胞迁移能力的变化。另外,用脂质体2000将人ILEI靶向性si RNA转染至HK-2细胞。相差显微镜观察正常组、TGF-β1诱导组、ILEI si RNA+TGF-β1诱导组的细胞形态变化,应用Western blot及RT-PCR检测正常组、Control si RNA 72 h组、ILEI si RNA 72 h组、TGF-β1诱导48h组、Control-si RNA 24h+TGF-β1诱导48 h组、ILEI si RNA 24h+TGF-β1诱导48 h组的E-cadherin,α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA的表达。同样,使用Transwell小室法检测各组HK-2细胞迁移能力的变化。最后,Western blot检测以上6组细胞的ERK、p-ERK、Akt、p-Akt蛋白水平的表达。结果:(1)过表达ILEI的HK-2细胞发生形态向成纤维细胞转化。(2)过表达ILEI 72h后,与正常组和vector组相比,过表达ILEI的HK-2细胞E-cadherin的蛋白及m RNA表达减少,而α-SMA及Vimentin的蛋白及m RNA表达增加。(3)过表达ILEI的HK-2细胞迁移能力增强。(4)给予TGF-β1诱导后过表达ILEI组较单独TGF-β1诱导组形态变化更加明显,迁移能力增强更加显著。(5)给予TGF-β1诱导后过表达ILEI组E-cadherin蛋白及m RNA表达较单独TGF-β1诱导组进一步减少,α-SMA及Vimentin蛋白及m RNA表达则进一步增加。(6)ILEI si RNA能恢复TGF-β1诱导的HK-2细胞的形态学改变。(7)ILEI si RNA作用于HK-2细胞后抑制TGF-β1诱导的α-SMA及Vimentin的蛋白和m RNA表达,ILEI si RNA能恢复被TGF-β1抑制的E-cadherin蛋白和m RNA的表达。(8)ILEI si RNA减弱了TGF-β1诱导的HK-2细胞的迁移能力。(9)ILEI si RNA作用于HK-2细胞后抑制TGF-β1诱导的p-ERK及p-AKT的蛋白水平的表达。结论:(1)过表达ILEI能够不依赖于TGF-β1独立诱导HK-2细胞发生EMT。(2)过表达ILEI可以促进TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间质转分化。(3)沉默ILEI能够抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化。(4)沉默ILEI抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化是通过AKT及ERK两条通路实现的。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R692
【部分图文】：

141A，TGF-β1 诱导对 HK-2 细胞形态的影响(倒置光学显微镜,x200)图 1B， TGF-β1 对 E-cadherin、α-SMA 及 Vimentin 蛋白表达的影响(Western blot)图 1C，TGF-β1 对 E-cadherin 及 Vimentin 蛋白分布的影响(免疫荧光 x400)注:control 代表对照组; 12h、24h、48h、72h 分别代表 TGF-β1 诱导不同时间组与对照组比较，**代表 P<0.01DAPI 标记的细胞核为蓝色，CY3 标记的 E-cadherin 及 Vimentin 为红色

16图 2A，不同 TGF-β1 诱导时间对 E-cadherin、α-SMA 及 Vimentin mRNA 表达的影响(RT-PCR)图 2B，不同 TGF-β1 刺激时间对肾小管上皮细胞迁移能力的影响注:control 代表对照组;；12h、24h、48h、72h 分别代表 TGF-β1 刺激不同时间组；与对照组比较,*代表 P<0.05，**代表 P<0.01

18图 3，TGF-β1 诱导肾小管上皮细胞中 ILEI 蛋白及 mRNA 表达A.TGF-β1 作用 HK-2 不同浓度对 ILEI 蛋白表达的影响(Western blot)B.TGF-β1 作用 HK-2 不同时间对 ILEI 蛋白表达的影响(Western blot)C.TGF-β1 对 ILEI 蛋白分布的影响(免疫荧光 x400)D.TGF-β1 作用 HK-2 不同浓度对 ILEI mRNA 表达的影响(RT-PCR)E.TGF-β1 作用 HK-2 不同时间对 ILEI mRNA 表达的影响(RT-PCR)
【参考文献】

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1 刘珊;王惠明;丁国华;;上皮间质转化在肾脏纤维化中的分子机制研究进展[J];临床内科杂志;2016年06期

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3 王琳娜;陈常勇;陈小永;郭存霞;陈香美;;依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织胰岛素样生长因子-1表达及肾小管上皮细胞转分化的影响[J];中国现代医学杂志;2015年26期

4 陶友丽;曹灵;;晚期氧化蛋白产物与慢性肾脏疾病的关系研究进展[J];山东医药;2014年47期

5 王来亮;罗群;;肾小管上皮间充质转化与肾脏纤维化[J];中国病理生理杂志;2014年10期

6 Minal Garg;;Epithelial-mesenchymal transition-activating transcription factors-multifunctional regulators in cancer[J];World Journal of Stem Cells;2013年04期

7 ;Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis[J];Chinese Medical Journal;2007年21期

本文编号：2835292