BCL6在减轻高血压的肾脏炎症和血管重构中的作用与分子机制

发布时间：2020-10-16 11:41

　　 原癌基因B细胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6,BCL6)是一种序列特异性的转录抑制因子,其结构包含N端疏水的BTB/POZ区域和C末端6个kruppel样的锌指结构。BCL6通过与靶基因启动子区域特异性的DNA序列结合,抑制其转录。受BCL6调控的靶基因主要与细胞的活化、分化、凋亡、细胞周期阻滞等相关。BCL6在维持巨噬细胞静息状态,终止炎症的过程中发挥重要作用。BCL6与辅抑制因子SMRT、NCoR结合,通过抑制炎症反应,改善小鼠动脉粥样硬化。本论文包括两个部分,分别探讨了(1)BCL6在高血压的肾脏炎症中的作用及其分子机制;(2)BCL6高血压的血管重构中的作用与机制。一、BCL6通过负调控NLRP3转录抑制肾脏炎症1.背景肾脏的慢性炎症在高血压的发生发展中起重要作用,改善肾脏炎症可能成为降血压的治疗手段。多种炎症疾病的模型中均存在核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小体的激活,然而NLRP3炎性小体在高血压肾脏损伤中的研究还十分有限。转录抑制因子BCL6负性调节NF-κB的表达,从而抑制NF-κB介导的炎症反应。已发现BCL6是自身免疫疾病和癌症治疗的治疗靶点。BCL6在高血压的肾脏炎症中的作用尚不明确。2.目的本研究拟探讨高血压炎症模型中BCL6对NLRP3炎性小体的激活和炎症的作用及其分子机制;并探讨慢病毒过表达BCL6对自发性高血压大鼠肾脏炎症的治疗作用。3.方法人肾小管上皮细胞系(HK-2)培养在10%FBS和1%双抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)的DMEM/F12培养基中,并且保持37℃,5%的CO2饱和湿度。人胚肾细胞系(293ET细胞)培养在10%FBS和1%双抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)的DMEM培养基中。在体实验部分采用13周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和WKY大鼠,随机各分成两组。肾实质分别注射BCL6或者对照ERFP的重组慢病毒,为确保BCL6过表达的有效性,2周后再次尾静脉分别注射BCL6或者对照ERFP的重组慢病毒。2周之后4组大鼠利用Powerlab测压系统测量清醒状态下的尾动脉收缩压(systolic arterial pressure,SBP)后分别进行取材和急性试验。利用尿素测定试剂盒和肌酐测定试剂盒检测血清尿素氮和肌酐的含量。采用蛋白质免疫分析技术(Western blotting)检测BCL6、NLRP3、含CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1前体(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1,pro-caspase-1)前体、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutropil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,kim-1)、胱抑素 C(CystatinC)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)前体及成熟体和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)表达。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测NLRP3及BCL6的表达。用real-time PCR(RT-PCR)检测BCL6、NLRP3、IL-1β、白细胞介素-6 Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosi s factor-α,TNF-α)、趋化因子 C CL2 和 CXCL2的mRNA水平。采用双荧光素酶报告基因检测BCL6 与 NLRP3启动子的结合活性。电泳迁移率变化分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色质免疫共沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等方法研究 BCL6 与 NLRP3 启动子结合的结合位点。4.结果(1)SHR大鼠肾皮质BCL6 mRNA和蛋白水平下调,NLRP3炎性小体激活。(2)AngⅡ或LPS抑制HK-2细胞的BCL6表达。在HK-2细胞,BCL6过表达不仅减弱AngⅡ引起的NLRP3的表达上调、炎症和细胞损伤,也减轻LPS引起的NLRP3的表达上调、炎症。(3)荧光素酶报告基因检测显示BCL6通过与NLRP3启动子结合抑制NLRP3转录,EMSA显示BCL6其结合点位于+283/+296,且这一结果与ChIP实验结果一致。(4)采用shRNA敲低HK-2细胞的BCL6水平可增加基础NLRP3、成熟IL-1β的表达和AngⅡ引起的NLRP3和IL-1β高表达,但对组成炎性小体的ASC和pro-caspase-1表达无显著影。(5)慢病毒介导的BCL6过表达降低SHR的血压、显著抑制SHR肾脏的炎性小体激活和炎症。5.结论BCL6通过抑制NLRP3转录减轻HK-2细胞AngⅡ或LPS诱导的炎症。SHR肾脏皮质中BCL6下调,慢病毒过表达BCL6抑制SHR肾皮质的NLRP3表达和炎症。二、BCL6抑制高血压的血管平滑肌细胞的增殖和氧化应激1.背景血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管壁中膜层的主要组成部分,VSMCs增殖在包括高血压、动脉粥样硬化和血管狭窄等心血管疾病中发挥重要作用。正常生理条件下VSMCs呈现低增殖状态,高血压血管损伤的病理状态下,VSMCs不断增殖导致血管壁的增厚。VSMCs增殖是血管重构的重要特征,血管重构是高血压发病机制的重要原因之一,因此干预高血压血管重构已成为防治高血压的重要切入点。然而,BCL6在高血压血管平滑肌细胞增殖中是否发挥作用尚不明确。2.目的本研究拟探讨BCL6对高血压模型中VSMCs增殖的作用及分子机制,并探讨BCL6过表达对SHR血管重构和血压的影响。3.方法人主动脉VSMCs培养在含10%FBS和1%双抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)的F12-K培养基中,并且保持37℃,5%的CO2饱和湿度。在体实验部分采用SHR和WKY大鼠,随机各分成两组,给予慢病毒过表达BCL6。采用Powerlab测压系统测量大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压,利用Western blot检测BCL6过表达和干扰的有效性。Masson染色(Masson's trichrome staining)检测主动脉的血管重构情况。利用CCK-8试剂盒检测BCL6对VSMCs增殖的影响,EdU掺入法检测BCL6对VSMCs的DNA合成速率的影响。Western blot检测样品增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、还原型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶 2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)和 GADPH 的蛋白表达。RT-PCR 检测待测样品 NOX2和NOX4的mRNA表达。Dihydroethidium(DHE)染色检测活性氧的变化。4.结果(1)过表达BCL6减弱Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖,降低Ang Ⅱ引起的VSMCs EdU阳性细胞数增加和增殖标志蛋白 PCNA的高表达。(2)过表达BCL6减弱Ang Ⅱ引起的VSMCs中NOX4的高表达,减少AngⅡ引起的ROS的产生增加,但是对NOX2的表达无明显影响。(3)干扰BCL6的表达,加重Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖及氧化应激。(4)慢病毒介导的BCL6过表达降低SHR的血压、显著抑制SHR血管重构及氧化应激。5.结论BCL6抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs增殖和氧化应激。慢病毒过表达BCL6降低SHR血压,减轻SHR血管重构和氧化应激.
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R544.1;R692
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一部分: BCL6通过负调控NLRP3转录抑制肾脏炎症
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分: BCL6抑制高血压血管平滑肌细胞的增殖和氧化应激
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
综述: NLRP3 炎性小体与肾脏疾病
    参考文献
英文缩略语
攻读学位期间发表研究论文及科研工作情况
致谢

【参考文献】

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1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

本文编号：2843208